[理学]生化药物制备第二章基因工程制药.ppt

第二章、基因工程制药 第一节、概述 现代生物技术是一项与医药产业相互结合极为密切的高技术。 1982年，第一个基因重组产品—人胰岛素在美国问世。 基因工程药物主要是医用活性蛋白和多肽类： 免疫蛋白、细胞因子、激素、酶类等 优点:大量生产、应用临床、 深入研究、扩大应用、改造不足 。 d. 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造； e. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 第二节、基因工程药物生产的过程 基因工程技术： 将所要重组对象的目的基因插入载体、拼接、转入新的宿主细胞，构建成工程细菌（或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达。 基因工程药物制药的主要程序 ⒈目的基因的克隆， ⒉构建DNA重组体， ⒊DNA重组体转入宿主菌， ⒋构建工程菌， ⒌工程菌发酵， ⒍表达产物的分离纯化， ⒎产品的检验等。 基因工程药物生产的基本过程 基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段 上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。 下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。 三、目的基因的获得 问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，为什么不能进行直接分离？ 目的基因的获取途径： 1、逆转录法 逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA 克隆表达。 （1）、mRNA purification（ mRNA 纯化） a.细胞内RNA的组成和含量: DNA:95%核内，5％细胞器 RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%; mRNA1-5% b.真核细胞mRNA 的特点及分离纯化方法。 3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT) (4)、cDNA cloning；质粒DNA：expression vector pUC ，pBR322噬菌体DNA: λgt11 ,λgt11等。 基因工程基本过程： 双重旋转对称的结构 或称回文序列(palindrome)。 (5)、将重组体导入host cell (6)、cDNA library identification （ cDNA 文库的鉴定） (7)、目的cDNA 克隆的分离和鉴定（限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、确定基因的 转录方向、转录起始点等。） 2、反转录—聚合酶链反应法 mRNA经反转录合成cDNA第一链，不需要再合成cDNA链，用于重组、克隆。 3、化学合成法 较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。 方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 人工化学合成基因的限制： a. 不能合成太长的基因。最长50-60bp.只适用于克隆小分子肽的基因。 b. 人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难， 如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完 全一致，易造成中性突变。 c. 费用太高。 筛选基因的其他方法 1 编码序列富集法 2 岛屿获救PCR法 *CpG岛 CpG岛（CpG islands）是指DNA上一个区域，此区域含有大量相联的胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G），以及使两者相连的磷酸酯键（p）。哺乳类基因中的启动子上，含有约40%的CpG岛（人类约70%）。一般CpG岛的长度约300到3000个碱基对（bp）。 常用的正式定义是指一个至少含有200bp的区域，其中GC所佔比例超过50%，且CpG的观察值／预测值比例必须高於0.6。 *持家基因(house-keeping gene) *Alu序列 Alu重复序列是哺乳动物基因组中SINE家族的一