[理学]第八章基因工程及其在医药工业的应用.ppt

第一节 基因工程的诞生、 原理、技术路线和发展 顺反子阶段 1957年，本泽尔（Seymour Benzer）以T4噬菌体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结构，提出了顺反子（cistron）概念。 　顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定1条多肽链。 现代基因阶段 四. 限制性内切酶图谱鉴 大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。 优越性： ①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。 ②有各类菌株和载体系列。 ③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。 ④易培养，成本低。 缺点： ①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。 ②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。 ③蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。 ④其内毒素很难除去。 二、外源基因在大肠杆菌表达系统中影晌因素及研究进展 减少包含体形成的策略： 1.构建融合蛋白或共表达； 2.降低重组菌的生长温度。 3.添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂。如高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖。 4.供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH值等。 不过，包含体的形成有时也是有利的，不仅可以获得高表达、高纯度的蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白的破坏。 有效、理想的复性方法应具备一下几个特点： 1.活性蛋白质的回收率高。 2.正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离。 3.折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。 4.折叠复性方法利用放大。 5.复性过程耗时较少。 甲醇酵母表达系统的优点 1.具有强启动子，可严格调控目的蛋白的表达。 2.可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性。 3.营养要求低，生长快，培养基廉价，便于工业化生产。 4.可高密度发酵培养。 （2）蓝-白筛选 它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码β-半乳糖苷酶的基因。 载体：编码β-半乳糖 宿主： 编码β-半乳糖 苷酶N端序列 苷酶C端序列 α-互补 细菌表达： β-半乳糖苷酶活性蛋白↑ 5-溴-4-氯-3-吲哚（ X-gal） → 形成蓝色菌落 当在质粒中插入外源DNA→β-半乳糖苷酶的N端基因失活→不能与宿主β-半乳糖苷酶的C端进行α-互补→产生白色菌落。 （IPTG 存在下） 蓝－白筛选示意图 （二)噬菌斑形成筛选法 当噬菌体载体系列包装外源重组DNA时，其重组分子长度是野生型的75%~105% ，即能形成有活性的噬菌体颗粒并在培养平板上出现清晰噬菌斑，而不含外源 DNA的单一载体，因其长度过小不能装配成活的噬菌体颗粒，感染细菌后也不形成噬菌斑，藉此可以达到初步筛选的目的。 (三)遗传互补法 利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞 某些重组体在宿主细胞中表达后，其表达产物可以与宿主细胞中的营养缺陷型突 变发生互补作用，根据这种特性可筛选重组体，尤其适用于外源基因导人哺乳动物后阳 性转化子的筛选。 如：利用无胸腺嘧啶培养基筛选含二氢叶酸还原酶(dihydrofolat ereductase DHFR) 重组子 (四)利用报告基因筛选植物转化细胞 使用目标DNA转染细胞后需通过细胞表达系统检索转染效率。研究调控因子时 常常采用融合基因瞬时表达系统，将一个报告基因置于顺式调控因子下游，根据报告基 因活性衡量顺式调控因子转录能力。 植物常用选择性标记基因 哺乳动物细胞常用GFP、CAT等 二、核酸分子杂交法 (一)菌落原位杂交(cloning/plaque in situ hybridization) (二) DNA 印迹(Southern blot)分析 (三) RNA印迹(Northern blot)分析 (四)斑点印迹杂交和狭线印迹杂交(Dot and Slot Blotting) 三、免疫分析筛选 原理：抗原抗体作用 本法适用于检测不向宿主提供任何可选择表型特 征的目的基因，适合筛选目的cDNA克隆，但需制备特异性抗体。 五. PCR筛选重组体 抽提少量重组DNA→PCR扩增→电泳鉴定→序列分析。 六、双脱氧终止法测序( Sanger法) 原理:利用DNA聚合酶所具有的两种酶的催化反应特性: ①DNA聚合酶能利用单?链DNA作模板合成出准确DNA互