[理学]细胞生物学实验-Hela细胞培养.ppt

　 若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。 　　一、细菌和真菌的清除 　　1、使用抗生素 　　抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。 预防用药一般用双抗生素，污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养基。此法在污染早期有效。 　　二、支原体的清除 　　１、用MRA等药物直接处理 　　用MRA（Mycoplasma Removal Agent）处理细胞，每4天换一次液，连续处理15天以确保细胞纯洁健康。　　2、用清洗纯化法清除支原体污染的方法 　　细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤 　　其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限，如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。 　　3、药物辅助加温处理 　　先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在40℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。 细胞污染的清除 1、试剂、耗材、器材消毒灭菌 细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。 2、操作过程 穿着容易起静电或容易吸附灰尘的衣物必须更换为白大褂后才能进入细胞间。 进入细胞培养间后关好门，坐下来尽量少走动以免影响生物安全柜的风帘。工作开始要先用75%酒精棉球擦手和瓶盖。事先要严格检查器材、溶液和细胞，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，以免造成大批污染。 细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时把隔板尽可能放低，尽量减少谈话，打喷嚏或咳嗽绝对不能对着工作区。 操作时要常更换巴斯德吸管、枪头和移液管，切勿一根管子做到底。一旦发现接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕及时收拾，保持实验室清洁整齐，最后用75％酒精清洁台面。 3、防止细胞交叉污染 在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，最好做上标记便于辨别。并按顺序进行操作，避免一起进行时易发生混乱。 在进行换液或传代操作时，粘有细胞的枪头和移液管不要触及培养基瓶瓶口，以免把细胞带到培养基中污染其他细胞。 所有细胞一旦购置、或从别处引入、或自己建立，均应及早留种冻存，一旦发生污染可弃之复苏，重新培养。 细胞污染的预防 1、第一次开始培养某种细胞 不管师兄师姐怎么介绍该细胞的培养方法，第一次开始培养某种细胞时，一定要去WWW.ATCC.ORG用该细胞的名称进行检索，可以得到关于该种细胞的详细信息，包括需要使用的培养基、血清、添加剂，通常的消化时间、传代时间等。对于特定的细胞（如原代培养的细胞），需要查阅相关文献来获得更准确的培养方法。 2、进入细胞间开始细胞培养时 确定所有的细胞操作用的溶液和耗材都已经消毒并检测没有问题，不确定的溶液和耗材请勿使用，除非特殊情况，不要借用别人的溶液。 确定衣服的袖口已经卷起或者白大褂的袖口已经扎紧。 确定戴的手套没有问题，只要接触过生物安全柜之外的物品，必须及时对手套进行消毒。 确定酒精灯内的酒精量，需要的话及时进行补充。 确定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。 细胞操作时动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口在火焰周围简单转动烧灼（过分烧灼会把瓶口烧坏）。 瓶盖应当倒放在远离自己的地方，以避免瓶盖被误操作所污染。 尽量不要直接倾倒溶液，除非瓶口没有被烧坏。如果倾倒失败，溶液粘在瓶口，请用喷过75％乙醇的纸巾仔细清洁瓶口周围（不要接触到瓶口）后在火焰上简单烧灼。 不要从敞开的容器口上方经过，以避免衣服上掉落不明物体对细胞的污染。 确定工作台的隔板已经放低，尽量减少谈话，打喷嚏或咳嗽绝对不能对着工作区。 操作时如果不能肯定所用的耗材是洁净，必须及时更换。 实验完毕及时收拾，保持工作区域清洁整齐，最后用75％酒精清洁台面。 细胞培养操作的注意事项 电动移液辅助器的使用规范 装载移液管时需要把刻度朝向自己，以更好衡量体积。 为了避免污染或者损坏电机，吸液不要超过移液管的警戒线，如果液体超过警戒线必须立即停止吸液，丢弃移液管，拆开移液管固定卡口检查液体是否进入滤器，如果液体已经通过滤器进入内部线路，必须及时送修，以免电机报废。 贴壁不紧的细胞，可以调到低档吹打细胞，贴壁紧的细胞可以调到高档进行吹打，发现吹打力量低时先检查档位是否在低档，如果不是就需要及时更换电池。另外为了避免产生气泡，吹打细胞时不要把液体