[理学]食品酶学-第7章.ppt

2、烷基化和芳基化法 该法是以卤素为功能基团的载体与酶蛋白的氨基或巯基发生烷基化或芳基化反应而形成固定化酶。 常用的载体为卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基衍生物。 3、溴化氰法 溴化氰法原理是多糖类载体在碱性条件下用溴化氰活化时，产生少量不活泼的氨基甲酸衍生物和大量的亚氨基碳酸酯衍生物，后者再与酶共价结合为固定化酶，其中异脲型是主要生成物。 它不局限于酶，可以广泛应用于机体成分的固定化。 由于此法能在非常缓和的条件下与酶蛋白的氨基发生反应，已成为近年来普遍使用的固定化方法，尤其是溴化氰活化的琼脂糖已在实验室广泛用于固定化酶以及亲和层析的固定化吸附剂。 4、载体交联法 载体交联法的原理为载体与酶蛋白发生共价结合或在双(多)功能试剂存在下载体与酶直接发生交联反应而形成固定化酶。现在该法广泛应用于酶的固定化。 常用的载体有氨基乙基纤维素、DEAE—纤维素、琼脂糖的氨基衍生物、壳聚糖、氨基乙基聚丙烯酰胺、多孔玻璃的氨基硅烷衍生物等。最常用的双功能试剂为戊二醛，此外还可使用甲苯—2，4—二异氰酸酯、Tris等。 四、交联法 使用双功能试剂或多功能试剂与酶分子间进行交联的固定化方法。 由于交联反应条件比较激烈，固定化酶活回收率一般比较低(30％左右)，但是尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间可有利于固定化酶活的提高。 第三节 固定化酶的特性 一、固定化酶的形状 二、固定化酶的性质 三、酶活力 四、固定化酶的稳定性 五、固定化酶的反应特性 一、固定化酶的形状 固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等。颗粒状占绝大多数，主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，也可用于工业化生产。 二、固定化酶的性质 酶经固定化后，依所用固定化方法的不同，固定化酶活力和其它性质均与游离酶有所不同。 三、酶 活 力 酶经固定化后，活力大部分下降。 这是因为： ①酶活性部位的重要氨基酸与水不溶性载体相结合； ②当酶与不溶性载体相结合时，它的结构起了变化； ③酶被固定化后，酶与底物的相互作用受到空间位阻的影响。 四、固定化酶的稳定性 固定化酶的稳定性一般要比游离酶提高很多，有利于工业生产。固定化酶的贮藏稳定性一般高于游离酶，但如长期贮存，酶活力也会下降。固定化酶制成后最好立即使用。 热稳定性对工业应用极为重要。多数酶，例如乳酸脱氢酶、脲酶等固定化后的热稳定性都较游离酶高，但也有一些酶的耐热性反而下降。 多数固定化酶的酸碱稳定性高于游离酶，这体现在其反应最适pH范围变宽。固定化酶在操作中可以长时间保留活力，半衰期在一个月以上即有工业应用价值。 五、固定化酶的反应特性 固定化酶的反应特性，例如，底物专一性、反应的最适pH、反应的最适温度、动力学参数、最大反应速度等均与游离酶有所不同。 (1)底物专一性 游离酶经固定化，由于空间位阻的影响，酶对高分子底物的活性显著减小。 (2)反应的最适pH 最适pH和pH曲线的变动取决于酶蛋白和水不溶性载体的电荷性质。有些酶在固定化后最适pH发生变化，而pH曲线不变。 (3)反应的最适温度 固定化酶的最适反应温度多数较游离酶高，但也有不变甚至降低的。 (4)最大反应速度Vmax 固定化酶的最大反应速度vm与游离酶多数是相同的。 (5)米氏常数Km 米氏常数Km表明了酶与底物的亲和力。固定化酶的Km与游离酶的Km有差异。使用载体结合法制成的固定化酶的Km有时发生变化，主要是由于载体与底物间的静电相互作用。 第四节 固定化酶的催化反应机理探讨 影响固定化酶的动力学因素 (1)酶分子构象的改变。 (2)微环境的影响。 (3)底物在载体和溶液间存在着分配效应。 (4)扩散效应。 第五节 固定化活细胞 固定化细胞 经过固定化载体固定化后，虽然整个细胞活力消失，但是，需要利用的“目的酶”仍保持催化活力 固定化活细胞 经载体在温和条件下固定化后，整个细胞仍保留细胞增殖活力和系列酶的活力(“目的酶”为主) 固定化活细胞更接近于天然细胞酶系统的催化作用，但其反应机理比固定化酶更复杂： (1)固定化对酶产生的某些影响对细胞同样有表现，例如增加其稳定性，其稳定性还可因两价离子和抗菌素存在而增加； (2)由于细胞内环境的相对恒定和细胞的缓冲作用,固定化对胞内酶产生的影响不像固定化酶那样明显； (3)固定化细胞除了受固定化因素影响外，还受细胞结构及细胞膜透性影响，如果经一定条件保温或表面活性剂处理，其酶活性相应升高； (4)固定化细胞还要考虑菌体生长、生理生化及它们在颗粒内的分布等问题： 固定化活细胞的制备条件比固定化酶更要温和，其制备方法主要有物理吸附法和包埋法两类。 固定化活细胞的制备方法 物理吸附法 物理吸附法 主要利用细胞和载体之间的静电引力和专一的亲和力作用