[生物学]10第十章 免疫细胞的分离和功能检测.ppt

第十章  免疫细胞的分离和功能检测 ☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取 聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞 吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。 （一）中性粒细胞功能检测技术 （二）巨噬细胞功能检测技术 细胞趋化功能的检测 吞噬功能的检测 杀菌功能的检测 体内试验法：皮肤窗法 体外试验法：滤膜渗透法 琼脂糖平板法 原理及技术要点 在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加入下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔，37℃温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、固定、干燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿越滤膜的移动距离，从而判断其趋化功能。 显微镜检查法 NBT还原试验 方法： 炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10％炭粒。据此给小鼠静脉注射定量印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。 Mф +CRBC PBMC包括：淋巴细胞、单核细胞 各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分离 常用分层液：ficoll－hypaque，percoll 　　 Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心的分离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。 原理： Ficoll分层液：密度1.077±0.001 离心：密度梯度离心 分离：各类细胞按其相应密度重新分布　　 ﹡红细胞的去除：低渗裂解法、氯化铵裂解法 ﹡血小板的去除 ：胎牛血清梯度离心法 ﹡单核细胞的去除：黏附法 羰基铁吞噬法（磁铁吸引法） 苯丙氨酸甲酯去除法 免疫磁珠分离法 流式细胞术分离法 其他方法 原理 将针对淋巴细胞特殊表面标志的某种特异性单克隆抗体与磁珠结合形成免疫磁珠（IMB），当特异性单克隆抗体与表达相应抗原的靶细胞结合，利用磁场可以将IMB所结合细胞与其他细胞分离。包被磁珠的抗体可以是第一抗体或第二抗体。 T细胞功能检测 B细胞功能检测 NK细胞功能检测 T细胞增殖试验 T细胞介导的细胞毒试验 MHC-肽四聚体技术 淋巴细胞内细胞因子检测 非特异性刺激物： PHA ------ T细胞 ConA ------ T细胞 PWM ------ T、 B细胞 LPS ------ B细胞 特异性刺激物： 异种抗原 同种组织抗原 形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法 原理： 原理： 原理: 试验方法: 同位素法 淋巴细胞（CTL）+含51Cr 的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏 51Cr 释放 测定γ射线 MHC-肽四聚体技术 技术要点 : 1.在体外将特异性抗原肽段、可溶性MHCI类分子重链及β2微球蛋白正确折叠，形成MHC-抗原肽复合物，并纯化该复合物。 2.用生物素标记MHC-抗原肽复合物。 3.生物素标记的MHC-抗原肽复合物与荧光标记的亲和素以4: 1的比例相混合，即得到荧光标记的四聚体 MHC-肽四聚体技术 原理: 用刺激剂体外激活淋巴细胞，用蛋白转运抑制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪便可测出淋巴细胞内的细胞因子种类，从而确定TH1/ TH2细胞的百分率。 特异性抗原皮肤试验 PHA皮肤试验 溶血空斑试验 酶联免疫斑点试验 体内试验 刺激体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌等。 将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。 三、相关功能检测 T细胞功能检测 淋巴细胞 DNA合成 分化 母细胞 刺激物 细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松 T淋巴细胞增殖试验 淋巴细胞转化的刺激物 淋巴细胞转化的检测方法 形态学检查法 无 有或无 有或无 伪足 无 有或无 有或无 浆内空泡 极少、天青色 增多、嗜碱 增多、嗜碱 胞质、着色 无 无 有或无 有丝分裂 无 有或无 清晰