[生物学]2 DNA克隆技术.ppt

酶切体系 DNA样品 1μl EcoR Ⅰ 1μl 10×bf 1μl 水 7μl 10μl 活力单位(IU): 一般 5 IU/μl 取1μl的酶可以消化5μM的DNA 二、限制酶切割 bp 1350─ 974─ 750─ 550─ 370─ 250─ 载体质粒 目的 基因 重组质粒 酶切 注意： 低温保存，冰上操作。贮存环境是甘油，避免反复冻融。 酶量不能超过反应体积的1/10。 无菌新的dorf管、枪头、去离子三蒸水。 DNA样品：一定纯度，不能混有酚 氯仿 EDTA SDS 过多盐类等 反应缓冲液：合适的pH值、盐离子浓度，配套提供 温度和时间：37℃ 1-2h 终止反应：EDTA SDS 加热 -20℃ 低熔点琼脂糖凝胶回收法 羟乙基修饰 凝固温度30℃ 溶化温度65 ℃ 胶回收 三、核酸片段的回收与纯化 浓度： 1 OD260 = 50μg/ml 双链DNA = 40μg/ml 单链DNA/RNA = 20μg/ml 寡核苷酸 纯度： DNA纯品 OD260/OD280=1.8 RNA纯品 OD260/OD280=2.0 四、核酸定量 常用：T4DNA连接酶 反应体系：越小越好 10 15 20μl 目的基因(300bp,200ng/μl) 5 μl 载体 (3000bp,1μg/μl) 1 μl 酶 1.5 μl 10×bf 1.5 μl 水 6 μl 15 μl 16℃ 24-48h 目的基因与载体等摩尔， 片段数之比为5:1 或10:1 五、DNA分子的连接 六、大肠杆菌感受态的制备与转化 取50μl~100μl JM109过夜培养物接种于3ml LB中 ↓ 37℃振荡培养2-3小时(OD600 0.2-0.4) ↓ 菌液置冰浴中冷却10分钟 ↓ 4℃ 5000rpm离心5分钟 ↓ 弃上清，沉淀细菌重悬于1ml预冷的0.1M MgCl2 ↓ 4℃5000rpm离心5分钟 ↓ 弃上清,沉淀细菌悬于1ml预冷的0.1M CaCl2 ↓ 冰浴20-30分钟 ↓ 4℃ 5000rpm离心5分钟 ↓ 沉淀悬于100μl CaCl2:甘油(4:1)溶液 ↓ -70℃保存备用 大肠杆菌感受态的制备 注意事项： （1） CaCl2 :甘油体积比为(4:1)。 （2）重悬细菌沉淀物时切忌剧烈震荡。 （3）感受态应该在-70℃保存，近期使用可以保存在-20℃。 （4）制备感受态应该用对数期菌(OD600 0.2-0.4)。 ( 5 ) 枪头和EP管需要新的高压灭菌。 （6）为避免杂菌污染，操作应在超净工作台进行。 重组质粒的转化 取5μl重组子or克隆质粒与100μl JM109感受态菌混合 ↓ 冰浴 30min ↓ 42℃热休克1～2min （最好90s） ↓ 冰浴冷却2～3 min ↓ 加400μl LB 37℃水浴震荡40 min ↓ 5000rpm 离心5min ↓ 留少许LB轻柔重悬菌体，涂布平板(含Amp的LB平板) (含Amp 100μg/ml) ↓ 37℃培养 注意事项： （1）热休克时间须严格掌握。 （2）注意重组体与感受态充分混匀。 七、DNA电泳 1、定义：带电物质在电场中的泳动。 2、影响因素： 样品物理性状 电 荷：越多，泳动越快。 分子大小：越大，泳动越慢 结 构：越小，越规则，泳动越快 DNA PI＝4， pH=8 — ＋ DNA plasmid 1％琼脂糖凝胶 泳动速度 环状 线性 切刻 电