[生物学]2显微切割技术120222.ppt

液压控制显微切割采用液压式显微操纵系统配合倒置显微镜进行显微切割，它通过液压系统可提供X轴、Y轴和Z轴三个方向的精确的三维控制．其切割精度较高、也是很多实验室常用的方法，但其不能实现显微切割的自动化，要收集较大量的目的组分时耗时长，效率低； 3. 液压控制显微切割 激光捕获显微切割是目前最为先进的方式，它快速方便，可从大量的研究材料中迅速捕获较多的目的组分，自动化程度高，但这需要昂贵的专用设备。 4. 激光捕获显微切割 激光显微切割系统 （三）显微切割的材料 为各种方式贴附于固相支持物上的各种组织细胞成分，石蜡组织切片、冰冻组织切片、细胞铺片、细胞爬片、细胞甩片、培养细胞、常规制备的染色体等。 根据研究目的 不同，选择不同材料 进行RNA分析 ----采用冰冻组织切片或新制备的细胞片； 回顾性研究----福尔马林固定石蜡包埋的组织切片应用最为广泛。 （四）显微切割的结合技术 1. 特定结构的识别显示技术 如何识别欲切割的细胞 ？ 根据研究的需要可在显微切割前应用组织化学、免疫组织化学、原位杂交、原位末端标记、原位PCR、FISH、组织特染等方法对需要切割的组织内成分进行标记。 需形态学知识 2. 如何对已切割的细胞进行分析 显微切割后获得的材料可以用于提取蛋白质、DNA和RNA等用于Western Blot，Southern Blot，Northern Blot，PCR等蛋白质和核酸的相关分析。  3. 活细胞显微切割后还可以继续培养 （五）显微切割的影响因素 1. 一切与显微切割结合的技术中的影响因素均为显微切割实验最终结果的影响因素 进行RNA的相关分析则所有过程必须确保无RNA酶的降解干扰； 如: 显微切割后与不同方法的结合决定了对切割材料处理不同: 进行基因组DNA的相关分析 应该保持基因组的相对完整性，避免在样品处理过程中造成DNA的降解和断裂，因此需要选择合适的方法进行样品的固定和保存，例如在福尔马林固定石蜡包埋的组织中由于固定包埋剂的影响存在较多的DNA断裂，而且随着保存时间的延长，DNA的断裂越多．因此欲分析的DNA需要保持完整时，选择石蜡切片进行显微切割则不合适； 2. 分离多少细胞或亚细胞才能满足实验研究的需要，依研究目的、标本固定方式、切片厚度、细胞大小、DNA提取方式、PCR扩增片段长度的不同而有差异 如: 显微切割用于DNA分析所需的单个细胞数 冰冻切片至少需要选取10个细胞，而石蜡切片一般需要选取30个细胞。 做蛋白质分析需要10 8个细胞。 如果要分析切割细胞中病原微生物的DNA情况、则细胞内病原体的拷贝数越多，需要的细胞数越少。 分析基因组DNA时，细胞越大．则需要切割更多的细胞，才能保证包含细胞的全部基因组。 冰冻组织切片较石蜡组织切片更适宜于对细胞基因组DNA的分析(后者DNA断裂)。 石蜡组织中存在DNA的断裂，如果要对其切割的细胞进行PCR分析，则扩增的片段越长，需要切割的细胞数越多。 从显微切割的细胞中提取DNA多采取直接法，即采用蛋白酶K消化后再加热灭活酶的方法，这样可以减少在提取过程中DNA的丢失。在采用激光捕获显微切割时或可以切割较多的细胞时．也可采用酚氯仿抽提方法提取细胞DNA。 组织切片厚度 在不影响形态观察的前提下，组织切片越厚越好， 石蜡组织一般选用7um的连续切片较为适宜。 Science. 1996 Nov 8;274(5289):998-1001. Laser capture microdissection. Emmert-Buck MR, Bonner RF, Smith PD, Chuaqui RF, Zhuang Z, Goldstein SR, Weiss RA, Liotta LA. Laboratory of Pathology, National Cancer Institute, Room 2A33, Building 10, 9000 Rockville Pike, Bethesda, MD 20892, USA. Comment on: Abstract Laser capture microdissection (LCM) under direct microscopic