[生物学]分子杂交.ppt

分子杂交 一、概述 1. 分子杂交 概念：用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针去探测样品中是否存在于其互补的同源序列的一种检测方法。 特点：具有高度的特异性和灵敏性，是定性或定量检测特异DNA或RNA序列片段的方法之一。 理想的探针具备的条件： 必须是一段已知的核苷酸序列 必须加以标记 便于杂交后的检测 （1）基因组DNA探针 利用机械剪切或限制性内切酶消化基因组DNA制备成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当的载体中，转化宿主细胞，构建成基因组DNA文库，进而进入文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆，经扩增、提取DNA、酶切及电泳分离，即可得到足够量的基因片段，经适当的标记后，即可作为探针使用。 （2）cDNA探针： 由mRNA转录而来，在逆转录酶的作用下，以mRNA 为模板，合成cDNA第一链，进而合成第二链。将合成的cDNA插入到适当的载体中，构建cDNA文库，然后筛选适当的阳性克隆，再进一步扩增、酶切及纯化该cDNA片段即可。 优点 双链探针，长度较长，可与靶序列形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高，杂交信号强。 缺点 由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过程中还存在自我复性现象。 （3）寡核苷酸探针： 由实验者设计、经核苷酸合成仪合成。目前的合成仪均可合成70-100bp长的寡核苷酸，但一般常用的寡核苷酸针长18-30bp。 缺点：探针短，与靶序列形成的杂交体稳定性差，对杂交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难度大；探针特异性差，背景噪音也大。 优点： （1）制备方便，实验者可根据需要自行设计，避免了天然核酸探针存在的高度重复序列。 （2）由于大多数寡核苷酸探针长度只有15-30bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响影响其熔解温度。因此它特别适用于基因点突变分析。 （3）比活度高，适用于大多数杂交，如DNA序列测定、Sounthern、Northern原位杂交等。 （4）RNA探针： 以双链DNA为模板，利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶于体外转录而成。 优点 ①RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高。 ②单链，不存在变性和自我复性。 ③RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交少。 ④杂交后可用RNase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。 缺点 RNA容易降解。 （5）单链DNA探针： 利用M13噬菌体载体合成。 优点 无自我复性现象。 缺点 需再克隆到M13载体中 杂交体不如RNA探针稳定 技术难度大 二、类型 三.核酸分子杂交（固相杂交）操作程序 四. 常用固相核酸杂交方法 Southern 印迹杂交法（Southern blotting ） Northern 印迹杂交法（Northern blotting ） 斑点杂交或狭缝杂交法（Spot/ Slot blot hybridization） 菌落杂交（colony hybridization） 夹心杂交法（sandwich hybridization） 原位杂交（ hybridization in situ） Western杂交 （一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 1、原理 硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强，当电泳后凝胶经过DNA变性处理，覆以上述滤膜，再于其上方压上多层干燥的吸水纸，借助它对深盐溶液的上吸作用，凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上。 转移是原位的，即DNA片段的位置保持不变。转移结束后，经过80℃烘烤的DNA，将原位地固定于膜上。 2. 固有膜 1）特点 良好的固相支持物应具备的条件： 具有较强的结合核酸分子的能力（10μg/cm2）。 与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反应。 与核酸分子结合牢固。 非特异性吸附少而不牢固，易于洗脱。 具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操作。 2）种类 优点 杂交信号本底较低。 缺点 ①由于是靠疏水作用结合DNA，这种结合并不十分牢固，随杂交及洗膜过程DNA会慢慢脱离硝纤膜而使杂交信号下降。②对小分子量的DNA片段（2