[生物学]分子标记.ppt

分子标记概念 广义的：是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。其中蛋白质标记又包括：同工酶标记和等位酶标记、种子贮藏蛋白标记。狭义：DNA标记。 DNA 分子标记：指在DNA水平上，通过一定方式或特殊手段来反映生物个体之间或种群之间具有差异的DNA片段。 分子标记的发展简史（一） 50年代中期以前：绝大多数遗传标记限于易鉴别的形态性状、生理性状和生化性状。 60年代初：同工酶标记，可从蛋白质水平反映生物的遗传变异，但同工酶的位点有限，与优良基因紧密连锁的基因更有限，未能改变遗传作图的缓慢节奏。 75年，Orodzicker首次利用RFLP（限制性片断长度多态性）进行腺病毒血清型突变体基因组作图，开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记的新阶段。 80年代，PCR技术的出现，又推动产生了许多新型的分子标记，如RAPD（随机扩增多态性DNA）。 分子标记的发展简史（二） 90年代以来，发展起来的： AFLP（扩增片断长度多态性） DAF（DNA扩增指纹分析，DNA Amplified FingerPrinting） CAPS（酶切扩增多态性序列，Cleaved Amplification Polymorphism） SSCP（单链构象多态性，Single-Strand Conformation Polymorphism） 微卫星DNA（Microsatellite DNA ） 小卫星DNA（Minisatellite DNA） SAP（特异性扩增子多态性，Specific Amplicon Polymorphism） DEGE（变性梯度凝胶电泳，Denaturing Gradient Gel Electrophoresis） 核苷酸排列顺序发生变化的原因： 一、单碱基突变 DNA序列中单个碱基的替换。 二、结构重排型DNA序列中发生缺失、重复、插入或所串联序列拷贝数相差悬殊 基本原理： RFLP标记间的连锁群确定 用大量不同的探针测定作图群体，不断积累资料，这些资料就可以用来构建RFLP连锁图。 第一个探针不可能为连锁提供资料，但从第二个探针开始，就可以确定二者之间是否连锁（看是否协同分离）。 原理：是将随机引物(通常9-10个碱基)与聚合酶链式反应(PCR)相结合,扩增基因组DNA的不同位点。如果基因组某些区域发生变异而导致特定结合位点的分布发生相应变化,会使产物增加、减少或发生分子量的变化,从而检测基因组DNA的多态性。 RAPD与标准PCR区别 RAPD无需专门设计引物，设计引物也不需要知道序列信息，反应中使用的引物是随机设计的，长度9-10bp。引物G+C含量40%以上； 标准PCR，必需根据已知的序列设计特点的引物，长度最好在20bp以上，G+C含量应接近50%。 在每个RAPD反应中，只加入一个引物就可扩增出许多片段(一般一个引物可扩增6～12条片段），而不是标准PCR的一对引物； RAPD反应使用较低的退火温度（一般36℃），能够产生严格且能重复的基因组特征性产物的多态性；标准PCR一般50℃左右（50-65 ℃）； 较标准PCR更易程序化，从而提高对基因组DNA进行分析的效率。 RAPD标记自身特点 用以进行RAPD分析的引物没有物种限制（动植物、微生物）。 继承了PCR的优点，因此具有分析方便、快速、模板DNA用量少等特点；与RFLP相比，RAPD无需克隆制备，同位素标记，Southern杂交、放射自显影或其它技术。 RAPD分析所用引物的数量可以是无限的，因此RAPD标记数量多，甚至可以覆盖基因组的所有位点； RAPD标记一般是显性遗传，不能区别生物个体是纯合型，还是杂合型 最大问题是重复性不太高,因为在PCR反应中条件的变化会引起一些扩增产物的改变; 由于存在共迁移问题,在不同个体中出现相同分子量的带后,并不能保证这些个体拥有同一条(同源)的片段; 同时, 只能分开不同大小的片段,而不能分开有不同碱基序列但有相同大小的片段。 扩增反应的引物： 在AFLP引物中，3’末端上选择性核苷酸数目的多少决定了AFLP扩增核苷酸数目。一般大于108bp的基因组DNA可以用3个选择性核苷酸；105-108的基因组DNA可以用2个选择性核苷酸。 引物长度一般18-20个核苷酸，由核心序列、内切酶位点序列和选择性核苷酸序列三部分组成。 * * 瑞士Zabeau等1992年发明 结合了RFLP和PCR技术的特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术高效性。 基本原理：对基因组DNA进行酶切，连上双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行选择性扩增。 它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。 AFLP (Amplified Restrict