[生物学]第三章 细胞的分离与破碎.ppt

第三章 细胞的分离与破碎 第一节 细胞的分离 第二节 细胞的破碎 基本要求： 了解细胞壁的组成与结构和常用破碎方法及破碎技术的研究方向，掌握破碎率的测定方法。 重点： 细胞壁的组成与结构；细胞壁结构与细胞破碎；常用破碎方法；破碎率的测定。 微生物的代谢产物可以分成两类：胞内产物和胞外产物（多数）。 胞外产物：分泌到细胞外的代谢产物。如大多数小分子代谢产物、细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等。 胞内产物：微生物分泌并在细胞内累积的代谢产物。如大多数酶蛋白、类脂、部分抗生素、基因工程产品（胰岛素、干扰素、白细胞介素-2等）。 在工业上利用微生物生产的大多数化学物质是胞外型的，它们是在微生物细胞内合成，然后再分泌到周围环境中；此外还有不少产物是胞内型的；以大肠杆菌为宿主进行表达的蛋白质产品多为胞内产物。 第一节 细胞的分离 微生物或动植物细胞培养，产物无论在胞外或胞内，都需进行细胞与培养液的分离。 常用的细胞分离方法（固液分离方法）包括过滤与离心沉降。 第二节 细胞的破碎 细胞破碎是指利用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜的过程。 细胞破碎的目的是破坏细胞外围使胞内物质释放出来。微生物的外围通常包括细胞壁和细胞膜。 细胞壁：为细胞外壁，具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤或渗透压破坏的功能。 细胞膜：为细胞内壁，是一层具有高度选择性的半透膜，控制细胞内外一些物质的交换渗透作用。 细胞破碎的主要阻力来自细胞壁，不同类型的微生物、处于不同生长时期的同一种微生物，细胞壁的结构特性是不同的，取决于遗传和环境因素。 红面包霉菌的细胞壁具有同心圆层状结构，主要存在三种聚合物：葡聚糖、几丁质（以微纤维状态存在）以及糖蛋白。 最外层a是葡聚糖；第2层b是糖蛋白的网状结构，葡聚糖与糖蛋白结合起来；第3层c主要是蛋白质；最内层d主要是几丁质，几丁质的微纤维嵌入蛋白质结构中。 细胞破碎方法按是否使用外力分为机械法和非机械法。 机械法有：珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法、 X-press法等。 使用机械法时，机械能转为热量，温度升高，多数情况下采用冷却措施。 非机械法有：酶溶法、化学法、物理法、干燥法等。 （一）机械法 1、珠磨法（Bead mill）（固体剪切方法） 工作原理：进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子和细胞之间剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。 珠磨机破碎是最有效的细胞物理破碎法。细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起。 实验室规模：Mickle高速组织捣碎机和Braum匀浆器。 中试规模：胶质磨 工业规模：高速珠磨机 破碎作用符合一级反应动力学，破碎程度用细胞破碎率（%）或单位细胞释放的内含物（mg/g）表示。 影响反应速率常数K的因素： 珠体直径：以细胞大小、浓度为选择依据； 珠体的装量要适中； 搅拌速度应适当：速度高，破碎率提高，能耗大； 操作温度：温度高，易破碎，控制在5~40℃，使目的产物不受破坏； 细胞浓度； 料液性质 延长研磨时间、增加珠体量、提高搅拌转速和操作温度等都可有效地提高细胞破碎率。 高破碎率将大大增加能耗；温度升高；大分子物质损失增加；细胞碎片较小，不易分离。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。 影响破碎的主要因素： 压力：增加压力，破碎率提高，但机械磨损较大，高压室的压力为55~70MPa。 通过匀浆器次数：增加次数，提高破碎率； 温度：控制使目的产物不受破坏； 细胞破碎的主要阻力来自细胞壁，破碎率与微生物的种类和生长环境有关： 酵母细胞较细菌难破碎； 静止状态的细胞比快速生长状态的细胞难破碎； 在复合培养基上培养的细胞较简单合成培养基培养的细胞难破碎。 在工业规模中，酵母等难破碎的细胞及高浓度的细胞，用多次循环破碎的方法。 不宜采用高压匀浆法破碎的细胞：