[生物学]第三章 细胞生物学研究方法.ppt

第二章 细胞生物学研究方法 本章内容提要 第一节 显微技术 一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、显微操作技术 第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养与细胞杂交 第一节 显微技术 光学显微镜：以可见光（或紫外线）为光源。 电子显微镜：以电子束为光源。 —、光学显微镜 （一）普通光学显微镜 1. 构成： ? ①照明系统 ? ②光学放大系统 ? ③机械装置 2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。 3、最高分辨率：0.2um，由光的波动性质决定（最小波390nm） R= 0.61λ N．sinα/2 4、三个条件： 1 必须用聚光透镜将一束亮光聚焦到样品上 2 需制备样品，使之透光 3 设置一套合适的透镜组 （二）荧光显微镜 ? 特点：光源为紫外线，波长较短，分辨力高于普通显微镜 ? 有两个特殊的滤光片 ? 照明方式通常为落射式 用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。 （三）激光共聚焦扫描显微境（LCSM） ? 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描 ? 能显示细胞样品的立体结构。 ? 分辨力是普通光学显微镜的3倍。 ? 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。 二、电子显微镜 （一）透射电子显微镜 原 理 以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50－120KV)的平方根成反比 ? 由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成 ? 分辨力0.2nm，放大倍数可达百万倍。 ? 用于观察超微结构，即小于0.2μm、光学显微镜下无法看清的结构， 又称亚显微结构。 不同光线的波长 2、制样技术 ? 1）超薄切片 ? 电子束穿透力很弱，用于电镜观察的标本须制成厚度仅50nm的超薄切片，用超薄切片机制作 ? 通常以锇酸和戊二醛固定样品，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式切片，重金属（铀、铅）盐染色。 2）负染技术 ? 用重金属盐(如磷钨 酸)对铺展在载网上 的样品染色；吸去 染料，干燥后，样 品凹陷处铺了一层 重金属盐，而凸的 出地方没有染料沉 积，从而出现负染 效果，分辨力可达 1.5nm左右。 3）冰冻蚀刻 ? 亦称冰冻断裂。标本置于 干冰或液氮中（－196℃） 然后断开，升温后，冰升 华，暴露出了断面结构。 向断裂面上喷涂一层蒸汽 碳和铂。然后将组织溶掉， 把碳和铂的膜剥下来，此 膜即为复膜（replica）。 （二）扫描电子显微镜 工作原理：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 扫描电镜主要用来观察样品表面的形貌特征，为避免干燥过程中样品因表面张力的作用发生变形，常采用二氧化碳临界点干燥法。 为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属膜，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。 （三）扫描隧道显微镜（STM） ? 原理：根据隧道效应而设计，当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV－2V），针尖与样品之间形成隧道电流。电流强度与针尖和样品间的距离有函数关系，将扫描过程中电流的变化转换为图像，即可显示出原子水平的凹凸形态。 ? 分辨率：横向为0.1－0.2nm，纵向可达0.001nm。 ? 用途：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。 思考： 比较电子显微镜和光学显微镜的优点及缺点。对下列目标你用什么方法做最佳观察：一个活的皮肤细胞、一个酵母线粒体、一个细菌、一条微管 能否用透射式电子显微镜反映样品的表面立体形貌，而用扫描式电镜反映样品内部的状况。 三、显微操作技术 ? 在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。 ? 显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 – 细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等上个世纪70年代在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作，并取得了丰硕成果。 第二节 细胞组分的分析方法 一、离心技术 ? 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基本手段 ? 转速为10－25kr/min的离心机称为高速离心机 ? 转速25kr/min，离心力89Kｇ者称为超速离心机 ? 目前超