竞争聚合酶链反应定量bcr-abl mRNA.docVIP

竞争聚合酶链反应定量bcr-abl mRNA方法的建立及应用 李巍　杜传书 　　我们根据bcr-abl基因的特点，用重组聚合酶链反应(PCR)法定点改建b3a2型bcr-abl cDNA，得到b3a2和b2a2型bcr-abl cDNA的通用竞争内标物。在此基础上，我们建立竞争PCR法定量检测bcr-abl mRNA的方法并初步用于临床。 材料和方法 1　竞争性内标物　利用本室经重组PCR构建的bcr-abl cDNA中一276bp片段的类似物mimic,长240bp,较原276bp片段仅中间部分序列缺失，两侧引物结合区完全相同。将其克隆至pGEM-5Zf(+)质粒上，得到的pGEM-mimic经紫外分光光度计(UV)定量后作为内标物。克隆过程中得到的突变重组子pGEM-mimic(m),经测序证实缺失mimic 中间一58bp片段，长182bp，作为 pGEM-mimic 的竞争模板，以此建立竞争PCR的实验条件。2　竞争逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)　外周血或培养细胞中总RNA提取、引物H 和C序列、bcr-abl基因RT-PCR反应条件均按文献［1］进行。竞争PCR中，以pGEM-mimic为内标物，将不同稀释度内标物与待测cDNA混合，或与一定量pGEM-mimic(m)混合，以H、C为扩增引物，按文献［1］RT-PCR反应条件进行32次循环。扩增产物用8%PAGE电泳和银染显色鉴定，并经图像分析仪扫描定量。3　图像分析　用IBAS图像分析系统(Kontron Electronik,Italy)，扫描得到各电泳带平均吸光度(A，曾称光密度OD)值。分别求出各泳道中待测物(T)带与内标物(M)带的平均吸光度比值(AT/AM)。考虑到待测物与内标物扩增带大小的差异，对b3a2型乘以校正系数0.87(240/276)；对b2a2型 乘以校正系数1.19(240/201)；对pGEM-mimic(m),乘以校正系数1.32(240/182)。以mimic 的amol数为横坐标，AT/AM为纵坐标，绘制定量曲线，查出AT/AM=1时，横坐标上对应mi-mic的 amol数为待测物浓度。以amol(mimic) 1μg总　　作者单位：510089　广州，中山医科大学医学遗传学教研室［李巍(现在深圳市罗湖医院　518001)、杜传书］RNA为浓度表示单位。起始模板中，mimic 为质粒双链，待测物为b3a2或b2a2 cDNA单链时，查得结果数应再乘校正系数2。4　实验对象　培养的K562细胞株为b3a2型bcr-abl mRNA阳性对照。1例b3a2型慢性粒细胞白血病(CML)患者，实施干扰素联用羟基脲化疗1年后，白细胞由治疗前的320×109/L下降到7.5×109/L，此时做第1次定量测定(K1)。1个月后患者白细胞升至12.9×109/L，做第2次定量测定(K2)。继续上述化疗方案半年后，白细胞降至8.3×109/L，做第3次定量测定(K3)。 结　　果 1　竞争PCR的循环次数　竞争PCR用于定量时的最佳条件是选择待测基因和内标物PCR扩增的同步增长期。将等浓度的pGEM-mimic和pGEM-mimic(m)各1μl加于25μl的PCR反应体系中，按竞争PCR条件进行20，25，32，35，40次循环。以循环次数为横坐标，扩增产物吸光度值为纵坐标，绘制图1。表明两者的指数变化期均为25～35个循环。选择32次循环为实验条件。 图1　竞争PCR循环次数试验 2　准确性与重复性　用已知浓度为108fmol的pGEM-mimic(m),分别用55，92，110，183，550fmol的pGEM-mimic内标物进行竞争PCR定量。求得5次pGEM-mimic(m)浓度分别为119，105，98，100，108 fmol,为106 fmol,s=8.28,CV=7.8%。表明竞争PCR准确可靠，重复性好。3　线性范围　分别将130，260，390，520，780 amol K562细胞b3a2型mRNA与275 amol pGEM-mimic进行竞争试验(见图2中6～10泳道)。以K562 b3a2 mRNA amol数为横坐标，测定的AT/AM为纵坐标，绘制图3。线性检测范围达520 amol。 1～5：K562细胞株定量PCR；6～10：线性试验；11：1kb分子量标准 图2　K562细胞株定量PCR及其线性试验电泳图谱 图3　定量PCR线性试验 4　灵敏度试验　将550 fmol pGEM-mimic渐次稀释到10-8仍可见扩增带，表明可检出到5.5×10-3amol水平，相当于331个分子数目。H、C引物扩增K562 mRNA可检出 10-5μg水平［1］，即可检出2.08×10-3amol水