[研究生入学考试]5 基因结构与表达分析的基本策略.ppt

第七章 基因结构与表达分析的基本策略 第一节 DNA序列分析 一、双脱氧链末端终止法 一、双脱氧链末端终止法 （dideoxy chain termination） 二、DNA自动化序列分析 DNA自动测序步骤 4种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTPs 平台效应（plateau effect）： PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入平台期。 二、耐热DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 从嗜热水生菌(Thermus aquatics YT-1) 株中直接分离出来。 Taq DNA聚合酶特性 ● 5′→3′聚合酶活性； ● 5′→3′外切酶活性； ● 逆转录酶活性； ● 较弱的非模板依赖性； ● 缺乏3′→5′外切酶活性。 4.其它原则: ① 引物长度: 10～30 nt PCR引物用量计算 四、PCR条件的优化 (一) Taq DNA聚合酶浓度： 1.0～2.5 U/100 μl反应液 五、PCR改进技术 2. 实时荧光定量PCR 3. 反向PCR（inverse PCR） 4. Alu-PCR 7. 不对称PCR（asymmetric PCR） 8. cDNA末端快速扩增技术 第三节 核酸分子杂交 （Nucleic Acid Hybridization ） 二、Southern印迹杂交(Southern blotting)  将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。 三、Northern印迹杂交(Northern blotting)  指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。 用于mRNA定性和定量分析。 第四节 基因芯片和微阵列 DNA Chip and Microarray 第五节 Western免疫印迹 Western blotting原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。 GAPDH 0d 2d 4d 6d 8d Northern blotting 检测基因表达 目的基因 基因芯片上的阵列是由有规则排列 的cDNA或寡核苷酸等样品所组成的 。 ● cDNA微阵列 ● 寡核苷酸微阵列 基因表达谱芯片主要技术流程 1.样品荧光标记 2.芯片制备 3.芯片杂交 4.芯片洗涤和扫描 5.扫描图像分析 5′CACTGAACGTAGGCCT3′ 3′GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5′ 特异扩增 5′CACTGAACGTAGGCCT3′ 3′GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5′ 错误引发 1. 引物与模板的序列要紧密互补 2. 引物不能在模板的非目的位点引发  DNA聚合反应(错配) 引物之间应避免3′端互补 5′CACTGAACGTAGGCCT3′ 3′TCCGGATGCAAGTCAC5′ 3.引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物自身不应形成发夹结构 ② 碱基分布: A、T、G、C 随机分布 ③ G+C含量：40 ～60% Tm=4(G+C)+2(A+T) ④ 引物3′末端碱基：最好选T、C、G，不选A 避免出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC ⑤ 引物5′末端碱基可不与模板DNA互补 引物5′端修饰技术 附加核酸序列 用 途 限制酶位点 克隆（如定向克隆） 噬菌体启动子 合成RNA探针、测序 蛋白质结合序列 产物纯化、检测 核糖体结合序列 高效表达 加错配碱基造成突变 定点诱变 1 A260 oligo DNA≈33μg N: 引物碱基数 X：合成的oligo DNA A260单位 Y：引物的pmol数 ?? 106 Y（pmol）= X·33×── 330 . N X = ──×105