[研究生入学考试]吉林大学生命科学学院生物化学5.ppt

3.9 氨基酸残基的测序 蛋白质测序有两种方法: 1. 通过氨基酸测序 2. 通过对应基因的DNA测序 通过氨基酸测序进行蛋白质测序的步骤 1. 确定多肽链数目; 2. 如果有多个肽链，分开; 3. 断开 (减少) 二硫键; 4. 确定每条链的氨基酸组成; 5. 通过Edman降解段蛋白水解酶和确定 N- 端和C-端残基; 6. 用特定的酶和化学手段将每个片段分为更小的片段; 7. 用 Edman 降解或质谱MS确定每个链的顺序; 8. 通过重叠的片段重建蛋白质的顺序; 确定二硫键的位置. §1. 确定 N- 端残基 1. FDNB二硝基氟苯： §2. 确定C- 段残基 1. 羧肽酶： (1)羧肽酶A 可以切碳端除了Lys、Arg、Pro的氨基酸 (如果第二个氨基酸是Pro则无法使用); (2)羧肽酶B可以切割C端的Lys或Arg (如果第二个氨基酸是Pro则无法使用); (3)羧肽酶Y切所有的氨基酸; (4)羧肽酶C切所有的氨基酸; 2. 肼解： 3. 还原： 肽链-COOH + 硼氢化钠 肽链-CH2OH 水解 氨基酸 +氨基酸-CH2OH （1）酶切： 1．胰蛋白酶： 精氨酸, 赖氨酸的C端. 特异性高 2．糜蛋白酶： 苯丙氨酸, 色氨酸, 酪氨酸的C端. 3．嗜热性蛋白酶：一些疏水氨基酸, 特异性低; 4．胃蛋白酶：一些疏水氨基酸, pH2, 特异性低; 5．木瓜蛋白酶： 精氨酸，赖氨酸 的C端.特异性低; 6．葡萄球菌蛋白酶（谷氨酸蛋白酶）： 磷酸盐缓冲液(pH7.8):谷氨酸、天冬氨酸的C端 NH4HCO3 缓冲液(pH7.8)： 谷氨酸的C端 NH4Ac缓冲液(pH4.0)谷氨酸的C端 7. 梭菌蛋白酶（精氨酸蛋白酶 ）：精氨酸的C端. Edman 降解用Edman试剂 从蛋白质的N端确定氨基酸的次序. §5. 切断二硫键 用过甲酸氧化二硫键: An example: 胰蛋白酶裂解: A-E-F-S-G-I-T-P-K L-V-G-K 糜蛋白酶裂解: L-V-G-K-A-E-F S-G-I-T-P-K Edman 降解: L Correct 正确顺序: L-V-G-K-A-E-F-S-G-I-T-P-K Edman degradation uses Edman reagent to determine the order of amino acids from the N-terminal end of a protein. 2. 其他方式: （1）DNS—Edman测序法; （2） 用荧光和冷光基团进行PITC ； （3）固相测序; 2. Other methods: （1）DNS—Edman; （2） PITC with fluorescent or luminescence groups； （3）Solid phase sequencing; §5. Cleave of disulfide bond Oxidation of a disulfide bond by performic acid: 2. 用含巯基的物质减少二硫键: 2. Reduction of S-S bridges by sulfhydryl compound: §6.通过重叠的片段重建蛋白质的顺序 §6. Reconstruct the sequence of the protein from the sequences of overlapping fragments §7. 确定二硫键的位置 1. 对角线电泳： §7. Determination of sites of disulfide bonds 1. Diagonal electrophoresis： 2. 部分还原： MS TCEP（三羧乙基磷酸） CDAP（1-氰基-4-（二甲氨基）吡啶四氟硼酸盐） 2. Partial reduction： 酶解法： 氨肽酶或羧肽酶, 只用于短肽测序. Enzymatic hydrolysis： aminopeptidase or carboxypeptidase, only short sequencing. 3. 质谱仪 3. Mass Spectrometer 测量基因中对应的DNA： Sequencing the corresponding DNA in the gene： PCR首个循环 First PCR cycles PCR 第二个循环 Second PCR cycl