q-rt-PCR技术.ppt

* * * * * * * 线性关系用来衡量重复样品数据是否一致和不同拷贝数的样品是否有相同的扩增效率。如果重复样品的CT值明显不一致，或样品的稀释梯度与CT值不成比例，则需要优化反应。 * 斜率：前提是10倍稀释，其范围才是上述数据。 MIQE简称mykee,是一套指导方针，提出了一个评价荧光实时定量PCR（QPCR）实验和发表文章时所要求的最低限度的必要信息标准。给出了一个当手稿提交给出版商时所要附带的checklist。 与DNA微阵列分析2，蛋白质组学实验3，基因组序列4，RNA干扰5，6及代谢研究7的标准一样，MIQE也被收到MIBBI（Minimum information for Biological and Biomedical Investigations )8旗下，作为荧光实时定量PCR的标准。它的内容非常详细，对QPCR的术语；概念；研究与临床应用；样本的采集、处理和制备；核酸的质量控制；反转录；QPCR过程；数据分析等方面的操作标准和规范都做了详尽的阐述。通过提供所有有关的实验条件和分析特性，评审可以评估研究者所用的实验方案的有效性。同时充分地披露所用的试剂，序列和分析方法，也使其他的研究者能够重现实验结果。按照这个准侧，也可鼓励较好的实验操作，和对实验结果有值得信赖的解释，帮助确保科学文献的完整性和可靠性，促进实验室之间的一致性，并增加实验透明度。也为进一步规范QPCR仪器和试剂的研发生产及市场做出了贡献。 * 免费的基于网络的设计软件 Primer5（primer3.ut.ee） - 引物和双标记水解探针的设计 -Tm的计算 MFold（ ） -引物和扩增产物二级结构的预测 -二级结构的稳定性(delta G) 和融解温度(Tm) BLAST（ /） -结构特异性 对照设置 阴性对照 Negative control: No template (NTC)： 检验是否有模板污染 No reverse transcriptase (NRT) : 检验RNA样品中是否有DNA污染 No amplification control (NAC) : 检验是否有聚合酶污染 No probe control (NPC) : 检验荧光污染 Buffer: Only contains buffer : 检验背景荧光 阳性对照 Calibrator: 可以用带有PCR扩增子的合成的RNA或cDNA寡核苷酸； 质粒DNA；克隆到质粒的cDNA；体外反转录的RNA；Reference RNA pools；来自于特定的生物体样本的RNA或DNA及国际上公认的生物学标准物。 Standard curve 反应体系优化 上机 反应条件优化 cDNA的合成 样品制备 模板准备 数据分析 退火温度优化：梯度PCR 延伸时间：产物长度决定 反应体积＞5ul，推荐20－50ul 引物浓度优化，模板量优化 Mg2＋调节，酶活调节 重复性扩增效率：90％－110％ ：std＜0.2 标准曲线：R＞0.99或R2 ＞0.98 SYBR法实验流程及注意事项 标准品 待测样本 阳性对照 阴性对照 技能要求 误差控制 仪器介绍 上机（qPCR） 试剂选择 cDNA的合成 样品制备 模板准备 数据分析 自配 realmastermix RCHO-Lightcycler series ROTOGEN-RG series BIO-RAD Opticon series ABI-7series Bioer－Linegene series 分装控制 内参控制 机器校正控制 平滑曲线，重复性好，灵敏度高 SYBR法实验流程及注意事项 数据分析 仪器介绍 分析方法 上机 cDNA的合成 样品制备 模板准备 相对定量：2－△△Ct法 绝对定量：标准曲线法 可靠，准确的数据 SYBR法实验流程及注意事项 qPCR体系的检验 用扩增曲线检验qPCR体系 用融解曲线检验qPCR体系 用标准曲线检验qPCR体系 用No-Template Control( NTC)检验qPCR体系（引物） 用No RT Control检验qPCR体系（模板） 扩增曲线 平滑 起始无扩增 起峰时间正常 NTC和NRC无扩增 或扩增起峰较晚 CT值是判断实验成功与否的重要参考 荧光定量PCR参数解析-- CT值 CT值主要是由反应中模板的初始浓度决定。模板浓度高，只需较少的扩增循环就可累积足够的产物，产生高过背景的荧光信号，那么CT值就会很早出现，相反CT值则会较晚出现。 大多数荧光定量PCR实验的CT值在18-30之间。 CT值在30-35个循环之内出现，需要多次重复试验以判断数据的准确性，然后再判断是否有目的基因的扩