九、流式细胞仪原理及应用、CD4绝对计数的原理、方法和质量控制概要.ppt

CD4绝对计数的原理、方法和质量控制 HIV感染中CD4+、CD8+T细胞测定的临床意义 淋巴细胞在免疫应答中起核心作用。 CD4+T淋巴细胞对细胞免疫和体液免疫平衡的维持具有枢纽的功能。 CD4+T淋巴细胞是HIV感染最主要的靶细胞。 HIV及其包膜蛋白的直接细胞致病作用 感染细胞-未感染细胞形成合胞体 程序性细胞死亡 自身免疫机制 特异性细胞毒T细胞对HIV感染细胞的破坏作用 HIV感染后CD4+、CD8+T细胞变化 CD4+T细胞（Th细胞）绝对计数持续减少 CD8+T细胞（Ts细胞）增高，到疾病晚期时下降 T细胞亚群比例倒置，CD4/ CD8 1.0 CD4+细胞功能受损 外周血中CD4+T淋巴细胞的数量是HIV感染疾病分期、预测疾病进程、制定抗病毒治疗和预防机会性感染方案以及评价治疗效果的实验室标准指标。 判断HIV感染者发生临床合并症的可能性并进行预防 确定抗HIV药物治疗开展的时机及进行疗效评价 虽然CD4+T细胞计数是监测HIV病程的评价工具，但是单独的CD4+T细胞数减少不是HIV感染的诊断检验。其它的免疫缺陷状况也可以有辅助性T-淋巴细胞数量减少的结果:- 丙球蛋白缺乏症- 胸腺发育不全 (DiGeorge氏综合症)- 严重的联合免疫缺陷 仪器的选择 1、中央级、省级、研究所、高校、医院：流式细胞仪（ FACSCalibur、Coulter) 2、地区级及示范区：专门的流式细胞计数仪（ FACSCount、Guava) 3、现场及乡镇卫生院：（手工方法：如 Dynabeads） 4、除此之外，在不具备CD4检测的实验室，WHO建议用总淋巴细胞来代替。（当总淋巴细胞小于1000/ul时，强烈预示CD4细胞小于200 /ul。 非流式细胞技术 免疫聚合磁珠 Dynabeads （利用光镜和免疫荧光染色） 细胞球 Cytosphere （利用计数板和光镜） Dynabeads技术计数CD4细胞 原理 用抗CD4单克隆抗体(mAbs)包被的磁化粒子捕获与分离全血中CD4T淋巴细胞 方法 将125?l新鲜血液，放入EDTA管，加350?lPBS，再加入25?l mAbs磁化悬浮粒子，在摇床(Dynal Mechnical Rotator) 上置室温10分钟混和，以便去掉血液中的单核细胞。磁化粒子用专门的磁性浓度计分离，并用PBS洗涤2次，加入50?l Lysing溶液，着色，用epifluorescent显微镜计数。 价格：3美元/人份 流式细胞术（flow cytometry, FCM） ●FCM的特点 保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏 从分子水平获取多种信号 对细胞进行定量分析或纯化分选 功能特点 （1）多参数定量分析每一个细胞； 　　（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。 ●流式细胞仪内部结构 数据处理系统 基本工作原理 散射光的测定 非荧光信号 荧光测量 数据的显示与分析 参数 FS SS FL 单参数直方图 一维参数（荧光或散射光）与颗粒技术（Count）构成，反映同样荧光强度的颗粒数量的多少 横坐标：光信号波长相对值（信道） 纵坐标：被测细胞的相对数量 双参数直方图 点图 二维等高图：等高线连接相同细胞数的点 密度图 假三维等高图 三参数直方图 流式细胞仪的多参数分析 Region设置 指在同一张单参数或双参数直方图上根据信号的强弱划定分析区域，从而计算分析区域内的细胞数量。 Gate设置 是指在某一张选定参数的直方图上根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。 流式细胞技术检测CD4+T细胞 样本制备(Lyse/No-wash 技术) 仪器性能 样本稳定性 制备后室温(20—25 0C)储存48小时 全血稳定性 采集后室温(20—25 0C )储存48小时 仪器性能 范围 CD4+: 50-2000个细胞/ uL CD8+: 100-2000个细胞/ uL CD3+: 100-3500个细胞/ uL 检测试剂盒组成（50人份/盒） 荧光试剂 2个组合/人份 CD4PE/CD3PE-CY5 CD8PE/CD3PE-CY5 固定液 效期 2—8 0C储存6个月 质控试剂盒（50人份/盒） 零，低，中，高 4种靶值微球 效期 2—8 0C储存1个月 使用简单方便 安装简便，一体式设计，无需外源计算机 即开即用，无需调试校准 全自动软件自动识别分析淋巴细胞群体 自动错误报警 实验报告 CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 CD