临床免疫学免疫原和抗血清制备参考.doc

第三章　免疫原和抗血清制备本章考点　　1.免疫原制备　　2.抗血清制备　　3.抗体的纯化和鉴定　　 第一节　免疫原的制备　　 　　免疫原　指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 　　　　一、颗粒性抗原的制备　　颗粒性抗原如各种细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。　　细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可； 　　细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。有的需经特殊处理，如鞭毛抗原需用0.3%～0.5%甲醛处理；菌体抗原加温100℃2～2.5h去除鞭毛抗原；毒素抗原则在杀菌后再加0.5%～l.0%氯化钙溶液等。 　　颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法，较少加佐剂作皮内注射。 　　　　二、可溶性抗原制备　　蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原，免疫前常需纯化。 　　（一）组织和细胞抗原的制备 　　1.组织和细胞抗原的制备：通常需要先将来源于人和动物的组织和细胞破碎，再经一定的方法纯化，才能获得所需的抗原。细胞破碎方法有： 　　（1）高速组织捣碎机法； 　　（2）研磨法（可用组织匀浆器或乳钵） 组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。 　　2.组织细胞或培养细胞可溶性抗原制备：除上述机械捣碎获取外，尚有酶处理法，常用胃蛋白酶或胰酶，可获得游离的单个细胞。 　　细胞抗原分膜蛋白抗原、细胞质抗原（主要为细胞器）、细胞核与核膜抗原，制备这些抗原前均需将细胞破碎，方法有： 　　（1）反复冻融法：一般-20℃反复冻融。 　　（2）超声破碎法：利用超声波机械振动原理使细胞破碎。 　　（3）自溶法：利用组织、细菌自身酶系统使之裂解。 　　（4）酶处理法：常用溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等使细菌或组织裂解。 　　（5）表面活性剂处理法：常用十二烷基硫酸钠等表面活性剂处理。 　　（二）超速离心分离法 　　用于分离亚细胞成分和蛋白质，是进一步纯化的第一次过筛。可分下列方法： 　　1.差速离心法：低速离心高速离心交替进行，分离大小差异的抗原颗粒； 　　2.梯度密度离心法：是一种区带分离法，通过梯度密度离心，使各类分子量的颗粒得以分离，也可以采用梯度柱的形式分离。 　　超速离心分离或梯度密度离心仅适用于少数大分子抗原及一些比重较轻的抗原，而不适用于大多数中、小分子抗原。 　　（三）选择沉淀法 　　选择沉淀法是采用各种沉淀剂或某些条件使抗原成分沉淀的方法。 　　1.核酸去除法：可采用氯化锰、硫酸鱼精蛋白等核酸提取沉淀剂，而核糖核酸降解法更简便（采用DNA或RNA酶）； 　　2.盐析沉淀法：常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩； 　　3.有机溶剂沉淀法：常采用乙醇或丙酮； 　　4.水溶性非离子型聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物为分子量为2000～6000的聚乙二醇（PEG）。 　　（四）凝胶过滤法 　　又称分子筛层析。通过凝胶分子筛作用，可将大、中、小三类分子分开，选择凝胶柱时应注意选用适于分离范围内的凝胶。 　　（五）离子交换层析法 　　离子交换层析是利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。常用的离子交换剂有： 　　1.具有离子交换基团的纤维素。 　　2.具有离子交换基团的交联葡萄糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺。 　　3.被覆以离子化物质的细粉。 　　4.凝胶合成的高度交联树脂。 　　（六）亲和层析法 　　亲和层析是利用生物分子间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体、DNA和RNA等之间有特殊亲和力，一定条件下，两者可紧密结合成复合物，如将复合物的一方固定于固相载体上，则可从溶液中分离和提纯另一方。 　　1.亲和层析支持物的选择：常用的有琼脂糖珠（sepharose2B、4B、6B）、琼脂糖、聚丙乙烯酰胺、多孔玻璃球等。 　　2.配体的选择：配体指具有亲和力的双方，或与受体特异性结合的结构物，作为免疫亲和层析则为抗原和抗体的同义语。良好配体必须具备抗原和抗体单一特异性；抗原和抗体间有较强亲和力；配体有一适宜的化学基团。 　　3.抗原或抗体与支持物的结合：结合的方法很多，可归纳为载体结合法、物理吸附法、交联法、网络法。 　　（七）免疫球蛋白片段的制备　　五种免疫球蛋白都具抗原性、皆可提取及纯化，但如分解成片段（如Fab片段、Fc片段、轻链片段等）作为免疫原可制备出分辨力更高的特异性抗血清。制备方法有： 　　1.温和条件下离析亚单位。如改变pH；用盐酸胍或脲等强变性剂将亚单位分开； 　　2.用