临床免疫学免疫电泳技术参考.doc

第七章　免疫电泳技术本章考点　　1.概述　　2.免疫电泳技术　　3.应用　　免疫电泳技术是根据抗原及抗体反应的高度特异性，电泳技术的高分辨力和具有微量、快速的特点，将凝胶内电泳与免疫扩散相结合的一项免疫学技术。 第一节　基本原理 　　　　一、原理　　 　　免疫电泳技术实质上是在直流电场作用下的凝胶扩散试验。它的原理是将凝胶扩散置于直流电场中，在一定的条件下，抗原及抗体离解成为带正电或负电的电子，在电场中向异相电荷的电极移动，所带净电荷量越多、颗粒越小，泳动速度越快，反之则慢。由于电流加速了抗原、抗体的运行速度，缩短了两者结合的时间，加快了沉淀现象的产生。当有多种带电荷的物质电泳时，由于静电荷不同，而区分成不同区带，使抗原决定簇不同的成分得以区分。　　影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗等。　　二、电解质和蛋白质的电离特性、电泳迁移率、电渗　　蛋白质的基本单位是氨基酸，在水溶液中具有两性电离特性，当缓冲液pH与蛋白质等电点（PI）相当时呈电中性，无电泳迁移性；缓冲液pH大于蛋白质等电点（PI）时带正电荷，向阴极端移动；缓冲液pH小于蛋白质等电点（PI）时带负电荷，向阳极端移动。　　在同一电场条件下，各种带电粒子在单位时间内的移动距离称电泳迁移率。　　在电场中液体对固体可出现相对移动，产生电渗现象。电渗不影响蛋白质的分离，但影响其原点位置。　　影响因素有：①电场强度；②溶液pH；③离子强度；④电渗。　　三、常用载体　　有琼脂和琼脂糖凝胶。其特点是提高了敏感性及反应速度，并可将带电性不同的组分区分开。 第二节　常用技术 　　　　免疫电泳常用技术有：　　1.对流免疫电泳：对流免疫电泳原理是将双向扩散试验与电泳相结合的定向加速的免疫扩散技术。　　在琼脂板上打两排孔，左侧各加入待测抗原，右侧孔内加入相应抗体，抗原在阴极侧，抗体在阳极侧。通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之间或抗体侧形成沉淀线。本法敏感度比双向扩散试验高8～16倍。　　　　图23 对流电泳示意图（1）为阳性，（2）为弱阳性，（3）抗原强阳性，抗原过量，（4）抗原强阳性　　2.火箭免疫电泳：火箭免疫电泳原理是将单向扩散试验与电泳相结合的免疫扩散技术。实质上是加速度的单向扩散。当待测抗原在含有适量抗体的琼脂板中泳动时，在抗原与抗体达到适当比例时。形成大的不溶性免疫复合物而沉淀，此沉淀物不再移动，未与抗体结合的抗原可穿过此沉淀，继续向前迁移并形成新的沉淀，随着抗原的减少，沉淀带越来越窄，形成火箭状沉淀，峰形高度与抗原量成正相关。当琼脂中抗体量固定时，以不同浓度的抗原泳动的沉淀峰高度绘制标准曲线。　　图24 火箭电泳　　　　（1）（2）（3）为标本　　（4）（5）（6）为标准抗原　　3.免疫电泳：是区带电泳和免疫双扩散相结合的一种免疫化学技术。检测原理是在普通琼脂中央纵向挖一2.0mm宽的小槽，两侧各打一孔，将待测标本与标准抗原分别加入两侧孔内进行琼脂区带电泳，各蛋白质抗原成分因分子量及电泳迁移率不同，分离成若干肉眼不可见的区带，然后将抗体放入槽内进行自由扩散，根据抗原电泳位置、含量及与抗体比例不同，而出现不同位置、不同形状和不同大小的沉淀线。待测样品与已知抗原相比较，可对待测样品的成分及性质进行分析。此技术为定性试验，目前主要用在纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常免疫球蛋白的识别与鉴定。　　图25 免疫电泳示意图　　　　4.免疫固定电泳：这是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术。检测原理是将血清蛋白质在琼脂糖凝胶介质上电泳后，再将抗血清直接加入电泳后蛋白质区带表面，或将浸有抗血清的滤纸贴于其上。参考泳道则加蛋白固定剂，作区带参考。孵育后，抗原与对应抗体直接发生沉淀反应，形成的复合物嵌于固相支持物中。经固定后的电泳凝胶在洗脱液中漂洗，将未结合的游离抗原或抗体洗去，则出现被结合固定的某种蛋白，氨基黑染色后观察结果。 　　 第三节　免疫电泳技术临床应用 　　　　免疫电泳目前大量应用于纯化抗原和抗体成分的分析及正常和异常体液蛋白的识别等方面；火箭免疫电泳作为抗原定量只能测定μg／ml以上的含量，目前较多应用于放射自显影技术；免疫固定电泳最常用于M蛋白的鉴定，此外免疫固定电泳也用于尿液中本周蛋白的检测及κ、λ分型、脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型。　　习题38 在对流免疫电泳中，抗体向阴性移动的原因是　　A.抗体带正电　　B.抗体带负电　　C.扩散作用　　D.电泳作用　　E.电渗作用 　　[答疑编号1] 　　『正确答案』E『答案解析』通电后，在pH8.4缓冲液中带负电荷的蛋白质抗原泳向阳极抗体侧，而抗体借电渗作用流向阴极侧，在两者之