临床免疫学沉淀反应参考.doc

第六章　沉淀反应本章考点　　1.概念　　2.液相内沉淀反应　　3.凝胶内沉淀反应　　4.免疫浊度法　　概念：沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在特定条件下特异性结合所出现的沉淀现象。 第一节　沉淀反应的特点 　　 　　1.沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。　　2.沉淀反应分两个阶段，第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，出现可溶性小复合物，肉眼不可见；第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成。如沉淀线、沉淀环。　　　　图19 两种抗血清形成的沉淀带 第二节　液体内沉淀试验 　　　　一、絮状沉淀试验　　 　　抗原抗体溶液在电解质的存在下结合，形成絮状沉淀物，这种絮状沉淀受抗原和抗体比例的直接影响，因此产生最适比例的测定方法，常见有：　　1.抗原稀释法：抗原进行一系列稀释与恒定浓度抗血清反应。　　2.抗体稀释法：抗体进行一系列稀释与恒定浓度抗原反应。　　3.为了保证抗原抗体在最适比例条件下进行反应，达到最大沉淀反应的效果，就必须对抗原和抗体最佳工作浓度做出选择。将上述我们讲过的抗原稀释法和抗体稀释法结合起来就是方阵滴定法，又称为棋盘格法。　　　　从上表中可以看出，Ab用1：40稀释时，Ag则应按1：320稀释；反之，Ag按1：160稀释，则Ab应按1：20稀释。　　又如在进行ELISA试验时，反应试剂多，其工作浓度不同对结果影响较大，因此必须对包被抗原（抗体）和酶标抗体（抗原）进行最佳工作浓度的滴定和选择，以达到最佳的测定条件，同样需要采用方阵滴定法进行实验找出抗原和抗体最佳稀释度。　　　　二、免疫浊度法　　　　免疫浊度法本质上属于液体内沉淀反应，其特点是将现代光学测量仪器、自动化检测系统和免疫沉淀反应相结合，可进行液体中微量抗原、抗体及小分子半抗原定量检测。　　（一）免疫浊度法原理　　当可溶性抗原与相应抗体在两者比例合适时，抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度，如形成的复合物增加，反应液的浊度随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算出受检物的含量。　　按照仪器设计的不同分为透射比浊仪测定法和散射比浊仪测定法。测定方法又可分为速率法和终点法。　　1.免疫透射比浊法：　　　　根据郎伯-比尔（Lambert-Beer）定律，当光线通过抗原抗体反应系统时，由于溶液中存在抗原抗体复合物，光线被吸收。吸收的量和复合物的量成正比。利用透射比浊仪测量出由于反射、吸收或散射引起的入射光衰减，其浊度以吸光度A表示，A值反映了入射光与透射光的比率。　　　　C：溶液浓度　　K：常数或cd　　c：分子吸光系数　　　d：光路长　　通常根据免疫比浊原理取多点（3～9点），按Y=a+bx+cx2+dx3的3次方取回归曲线进行定标，制定剂量-反应曲线。免疫透射比浊法快速，测量可进行自动化，常用于临床体液蛋白的检测。 　　2.免疫速率散射比浊法：　　图20-2 散射免疫浊度法及透射免疫浊度法示意图　　　　其原理是指一定波长的光通过溶液遇到抗原抗体复合物时，光线被折射，发生偏转。偏转角度可以从0-90°，这种偏转的角度可因光线的波长和复合物大小不同而有所区别。散射光的强度与复合物的含量成正比，即待测抗原越多，形成的复合物也越多，散射光也越强。同时也和散射夹角成正比，和波长呈反比。　　测定方法有终点法和速率法两种。　　终点法是在抗原-抗体反应达到平衡时，即复合物形成后作用一定时间，通常是30-60min，复合物浊度不再受时间的影响，但又必须在聚合产生絮状沉淀之前进行浊度测定。　　速率法是在抗原抗体结合反应的过程中，在单位时间内两者结合的速度。速率法是测最大反应的速度，即反应达到顶峰时的峰值。抗原抗体结合反应在几十秒内得出结果，峰值的高低与抗原的量成正比，峰值出现的时间和抗体浓度、抗原抗体的亲和力直接相关。速率法的灵敏度和特异性都比终点法好。　　但是，必须指出的是对免疫浊度法存在难以克服的钩状效应。即在定量抗体中加入抗原量达到最佳比例时，形成的IC量最大，反应速度最快。如继续加入抗原，形成IC的量不但不再增加，反而减少；反之，在定量抗原中加入抗体，在抗体过量时也会产生同样的现象。这种后带（抗原过量）和前带（抗体过量），统称为钩状效应（hook effect）。钩状效应可以产生假象的弱阳性或假阴性结果。　　（二）与免疫浊度法测定密切相关的因素有：　　1.抗原与抗体的比例：理想状态是抗原与抗体比例合适全部结合，事实上有困难，根据Heidelberger曲线理论，反应液中保持抗体过量时，复合物随抗原量的增加递增至抗原与抗体两者比例最合适时达高峰，因此免疫浊度法中保持抗体过量；　　2.抗体的质量：应是特异性强、