免疫细胞分离及检测技术参考.doc

第十三章　免疫细胞分离及检测技术本章考点　　1.免疫细胞的分离　　2.淋巴细胞表面标志的检测　　3.淋巴细胞功能检测技术　　4.免疫细胞检测的临床意义 第一节　免疫细胞的分离 　　　　一、外周血单个核细胞的分离　　1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间。因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。　　2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种　　（1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。见下图。　　图 聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图　　引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷　　　　（2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。　　图 连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图　　引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷　　　　二、淋巴细胞的分离　　1.纯淋巴细胞群的采集：利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。主要的方法有：①粘附贴壁法；②吸附柱过滤法；③磁铁吸引法。　　2.淋巴细胞亚群的分离原则：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法，而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞为阴性选择。常用的方法包括：①E花环沉降法；②尼龙毛柱分离法；③亲和板结合分离法；④磁性微球分离法及荧光激活细胞分离仪分离法。　　三、淋巴细胞的保存与活力测定　　1.淋巴细胞的保存技术　　（1）短期保存技术：将分离的细胞用适量含10%～20%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMIl640或其他培养液稀释重悬。短期保存可置于4℃保存。　　（2）长期保存技术：液氮深低温（-196℃）环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。　　2.活力测定：最简便常用的为台盼蓝染色法。台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。 第二节　淋巴细胞表面标志的检测 　　　　一、T细胞表面标志的检测 　　　　1.特异性抗原检测：用单克隆抗体检测T细胞表面抗原的方法有两大类：一类是用标记抗体染色，如免疫荧光法、酶免疫法、ABC法及免疫金银染色法；另一类用抗体致敏的红细胞作花环试验。　　2.特异性受体的检测原理：T细胞表面有特异性绵羊红细胞（E）受体，当人的T细胞与绵羊红细胞悬液按一定比例混合后，置4℃至少2小时或过夜，T细胞表面的E受体可与绵羊红细胞结合形成玫瑰花样的花环，称为活性E（Ea）花环。检测Ea花环形成细胞可反映受检者的细胞免疫水平。　　3.T细胞亚群检测：见第二十二章流式细胞仪分析技术。　　二、B细胞表面标志的检测　　B细胞具有多种特异性抗原和受体，据此建立了相应的检测方法，一般用以研究B细胞各分化发育阶段的特性，也可藉以鉴定和计数各阶段B细胞在人外周血和淋巴样组织的分布以及疾病时的变化动态，为临床提供诊治相关疾病的有用信息。　　1.B细胞表面抗原的检测：B细胞表面有CD19、CD20、CD21、CD22和CD29等分化抗原，其中有些系全部B细胞所共有，而有些仅活化B细胞所特有，据此可用相应的CD系列单克隆抗体，通过间接荧光免疫法、酶免疫组化或ABC法加以检测。　　2.Sm