正向间接血凝试验（讲课）.ppt

正向间接血凝试验（IHA） 内 容 一、间接凝集试验简介 二、正向间接血凝试验（IHA）原理 三、IHA试验操作步骤 四、IHA试验结果判定 五、IHA试验注意事项 一、间接凝集试验简介 将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应或被动凝集反应。 1.1载体的种类及处理方法 常用载体有：红细胞（如绵羊红细胞）、聚苯乙烯胶乳颗粒、明胶颗粒、离子交换树脂、活性炭、火棉胶等。 处理方法：颗粒表面的处理（醛化、鞣化、化学处理）。 1.2间接凝集反应的类型： 1. 正向间接凝集反应 2. 反向间接凝集反应 3. 间接凝集抑制反应 4. 协同凝集反应 1.2.1（正向）间接凝集反应 用抗原致敏载体以检测样品中的相应抗体 1.2.2 反向间接凝集反应 用特异性抗体致敏载体以检测样品中的相应抗原。 1.2.3 间接凝集抑制反应 诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体和相应的抗体，用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。检测方法为将样品先与抗体试剂作用，然后再加入致敏的载体，若出现凝集现象，说明标本中不存在相同抗原，抗体试剂未被结合，因此仍与载体上的抗原起作用。如标本中存在相同抗原，则凝集反应被抑制。 间接凝集抑制反应原理示意图 1.2.4 协同凝集反应 协同凝集反应与间接凝集反应的原理相类似，但所用载体既非天然的红细胞，也非人工合成的聚合物颗粒，而是一种金黄色葡萄球菌。它的菌体细胞壁中含有A蛋白SPA具有与IgG的Fc段结合的特性，因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体。如与相应抗原接触，即出现反向间接凝集反应。协同凝集反应也适用于细菌的直接检测。 二、正向间接血凝试验 血凝试验是红细胞凝集试验的简称。间接血凝试验是以红细胞作为载体的间接凝集试验，在临床检验中应用广泛。 用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验（IHA）。 二、正向间接血凝试验原理 抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下会形成抗原复合物，但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。若将抗原吸附（致敏）在经过特殊处理的红细胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗体的反应灵敏性。这种经过口蹄疫纯化抗原致敏的红细胞与口蹄疫抗体相遇，红细胞便出现清晰可见的凝集现象。 2.1 载体 最常用的载体颗粒为绵羊、家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞。新鲜红细胞能吸附多糖类抗原，但吸附蛋白质抗原的能力较差。致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，只能使用2～3天。为此一般在致敏前先将红细胞醛化，可长期保存而不溶血。 常用的醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。红细胞经醛化后体积略有增大，两面突起呈圆盘状。 2.1 载体 醛化红细胞具有较强的吸附蛋白质抗原的能力，血凝反应的效果基本上与新鲜红细胞相似。如用两种不同醛类处理效果更佳。也可先用戊二醛，再用鞣酸处理。醛化红细胞能耐60℃加热，并可反复冻融不破碎，在4℃可保存3～6个月，在－20℃可保存一年以上。 2.2 致敏 致敏用的抗原要求纯度高，并保持良好的免疫活性。 用蛋白质致敏红细胞的方法有直接法和间接法。直接法只须在低pH，低离子浓度下，用醛化红细胞直接吸附即可。间接法则需用偶联剂将蛋白质结合到红细胞上。常用偶联剂为双偶氮联苯胺和氯化铬。 三、IHA试验操作步骤 1 加稀释液 在血凝板上1-6排的1-9孔；第7排的1-4孔、第6-7孔；第8排的1-12孔各加稀释液50μL。 2 稀释待检血清 取待检血清50μL加入第1排第1孔，并将枪头插入孔底，右手拇指轻压弹簧1-2次混匀（避免产生过多的气泡），从该孔取出50μL移入第2孔，混匀后取出50μL移入第3 孔……直至第9孔混匀后取出50μL丢弃。此时第1排1-9孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：1:2⑴、1:4⑵、1:8⑶、1:16⑷、1:32⑸、1:64⑹、1:128⑺、1:256⑻、1:512⑼。 三、IHA试验操作步骤 3 稀释阴性对照血清 在血凝板的第7排第1孔加阴性血清50μL，对倍稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2⑴、1:4⑵、1:8⑶、1:16⑷。第6-7孔为稀释液对照。 4 稀释阳性对照血清 在血凝板的第8排第1孔加阳性血清50μL，对倍数稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50μL丢弃。此时阳性血清的稀释倍数依次为1：2-1：4096。 三、IHA试验操作步骤 5 加血凝抗原 被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加O型血凝