第11章 动物细胞培养所需的基本条件.ppt

细胞培养的甚本概念 传代： 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 原代培养： 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。 细胞培养：使用单个细胞悬液进行培养的方式 组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米） 器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫 培养细胞的生物学特性 体外培养细胞的分型 培养细胞的生长方式有两种： 贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞 悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞 上皮细胞型 细胞扁平，不规则多角形，中间有胞核，彼此紧密相连，呈单层生长。消化道上皮，肝、肺泡上皮等起源于外胚层和内胚层的细胞在体外培养时一般呈上皮细胞型。 成纤维细胞型 呈梭形或不规则三角形，胞质外有2～3个突起。起源于中胚层的细胞，如心肌、平滑肌、血管内皮细胞等 游走细胞型 呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则 。单核细胞、巨噬细胞及部分肿瘤细胞。 多形细胞型 呈多角形，并伸出较长的神经纤维，形状难以确定。神经元核神经胶质细胞 淋巴细胞、白细胞、部分肿瘤细胞 生存空间大，生长密度大。 贴附 接触抑制 密度抑制 2、细胞系的生长过程 细胞系(cell line):原代培养物成功传代后,则称之为细胞系 培养细胞生命期：是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。 体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。 胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维待一年左右的生存时间，最后衰老凋亡（Apoptosis）。 原代培养期 也是初代培养，从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。 贴壁慢，生长慢。与组织细胞相似性大，比较适合作各类测试。 传代期 一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。 衰退期 此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡 3、每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟——4小时 贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10 分钟一4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） 潜伏期 此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～96小时。 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 11.1.1 水和平衡液 1、水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 2、平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS： NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56g KH2PO4 0.20g 加水至1000 ml BBS:见书 1、培养基营养成分： 氨基酸：是细胞合成蛋白质的原料。有细胞都需要12种必须氨基酸：缬氨酸、亮、异亮、苏、赖、色、苯丙、蛋、组、酪、精氨酸、胱氨酸。此外还需要谷氨酰胺，它在细胞代谢过程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的来源。 单糖：培养中的细胞可以进行有氧与无氧酵解，六碳糖是主要能源。葡萄糖 维生素：主要扮演辅酶、辅基的角色，必不可少。生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素、维生素B12都是培养基常有的成分。 无机离子与微量元素：细胞生长除需要钠、钾、钙、镁、氮和磷等基本元素，还需要微量元素，如铁、锌、硒、铜、锰、钼、钒等。  促生长因子及激素： 各种激素、生长因子对于维持细胞的功能、保持细胞的状态（分化或未分化）具有十分重要的