第13章动物 细胞融合和杂交瘤技术.ppt

13.1 动物细胞融合技术 13.2 杂交瘤技术与单克隆抗体生产 动物细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交(somatic hybridization)，是指将不同来源的原生质体相融合并使之形成新产品技术。 是20世纪60年代发展起来的一项细胞工程技术。 13.1 动物细胞融合技术 (4) 动物细胞融合影响因素 融合方法 亲本细胞表面性质 细胞种类 细胞融合时的适宜温度和运动状态 氧含量 Ca2+ PH 生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与培养条件反应的差异选择杂种细胞。如激素、氨基酸、碳水化合物营养成分要求不同，温度条件不同等。 物理特性筛选法：利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度等差异选择杂种细胞。如用离心法可将异核体与亲本原生质体分开，从而获得融合体。 荧光标记筛选法：用荧光激活细胞分选仪可自动分类和选择融合细胞。 什么是抗体？ 　抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 B淋巴细胞产生抗体。 B淋巴细胞与抗体 B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。 动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。 每一个B淋巴细胞只能产生一种针对某一抗原的抗体。 B淋巴细胞在体外不能增殖。 定义：肿瘤细胞与体细胞融合形成的杂交细胞称为杂交瘤细胞，建立杂交瘤细胞系的技术称为杂交瘤技术。通常多指B细胞杂交瘤技术。 该技术将骨髓瘤细胞与B细胞融合，以建立能分泌针对某一种抗原的抗体的杂交瘤细胞系为目的，也称为单克隆抗体制备技术。 13.2.1 亲本选择 （1）瘤细胞：对选择剂敏感，对数生长期细胞，37℃，含5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。 （2）抗体生成细胞：采用腹腔注射抗原（细菌、病毒或某种纯的蛋白），一般注射三次。使小鼠脾内产生抗体，制备免疫脾细胞悬液。 （3）饲养层细胞的制备：用小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞。 13.2.2 细胞融合（过程） 将对数生长期的免疫脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞以10：1或5：1的比例混匀。 离心，吸净上清液，加入40-50%的PEG，10-20min后加入培养液，终止PEG作用。 离心，弃上清，用HAT选择培养液悬浮细胞，加到含饲养细胞的96孔培养板内，每孔100微升，37℃，5%CO2培养箱培养。 融合细胞在3-6天开始形成克隆，其余细胞逐渐死亡。 13.2.3 杂交细胞的筛选 筛选的原理与方法：普遍采用的HAT选择性培养液是在普通的动物细胞培养液中加入次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）。 其依据是细胞中的DNA合成有两条途径：一条途径是生物合成途径（“1途径”），即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，为DNA分子的合成提供原料。在此合成过程中，叶酸作为重要的辅酶参与这一过程，而HAT培养液中氨基喋呤是一种叶酸的拮抗物，可以阻断DNA合成的“1途径”。 另一条途径是应急途径或补救途径（“2途径”），它是利用次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶脱氧核苷激酶（TK）催化次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相应的核苷酸，两种酶缺一不可。因而只有具有这两种酶的细胞才能在HAT培养基中生长。 因此，在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“1途径”被氨基喋呤阻断，虽“2途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。 对于骨髓瘤细胞以及自身融合细胞而言，由于通常采用的骨髓瘤细胞是次黄嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型（HGPRT）细胞，因此自身没有“2途径”，且“1途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。 惟有骨髓瘤细胞与效应B细胞相互融合形成的杂交瘤细胞，既具有效应B细胞的“2途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性，因此能在HAT培养液中选择性存活下来，并不断增殖。 HAT液筛选后的融合杂交细胞要通过酶联免疫法、放射免疫测定法等方法进一步检测，筛选能分泌针对特定抗原产生特异性抗体的杂交瘤细胞。 13.2.4 杂交瘤细胞的克隆培养 采用稀释铺板法和软琼脂培养法 13.2.5 单克隆抗体的生产 将稳定的单克隆杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，从腹水中分离、提取单克隆抗体。 将杂交瘤细胞在培养瓶或生物反应器中离体培养，再从培养液中回收产生的抗体。 植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较 * 第13章 动物细胞融合和杂交瘤技术 动物细胞融合 细胞融合是正常的生命活动 两个细胞正在融合 受精作用 × × × × * * * * × * 细 胞 融 合 培养基筛选 新 产品 细胞融合原理示意图 主要步骤： 细胞靠近、细胞桥形成、胞质渗透、核融合。 显微镜下细胞融合过程 引自：韩贻