医学分子生物学_7_分子生物学常用技术教材教学课件.ppt

四、PCR循环参数 变性温度和时间 模板DNA和PCR产物须完全变性（成单链，引物才能在退火过程中与模板结合。） 通过加热实现变性。在90～95℃，DNA分子都会变性。按模板DNA的复杂程度（如G+C含量、模板DNA分子大小),可调整变性温度和时间。温度过高和时间过长，对PCR反应不利。 退火温度和时间 退火温度对PCR反应的特异性有重要影响。合适的退火温度应低于引物Tm值5℃左右。 退火温度过低，引起非特异性扩增产物增多；退火温度过高，PCR扩增产量下降。在允许范围内，选择退火温度的原则：在保证产量的前提下，尽量提高退火温度。 退火时间一般选择30 s～1 min, 足以使模板与引物完全结合。 延伸温度和时间 延伸温度一般为72℃左右。 延伸时间需根据待扩增片断的长短作适当调整。 2kb以内的扩增片断，延伸1 min即可。延伸时间过长易发生非特异性扩增。 循环次数 理论上，20～25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值。 实际操作中，可以35个cycle. * 30个循环后出现“平台效应” Reality vs. Theory Theoretical Real Life Log Target DNA A linear increase follows exponential Eventually plateaus Cycle # * 逆转录PCR 原位PCR 重组PCR 不对称PCR 多重PCR 反向PCR 五、PCR衍生技术 锚定PCR 巢式PCR 实时PCR 递减PCR * 原理 第一步反应： 以提取的组织或细胞RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA； 第二步反应： 以合成的cDNA为模板，通过常规PCR反应来扩增目的基因. （一）逆转录PCR技术 RT-PCR的实验操作： 1.两步法RT-PCR 2.一步法RT-PCR 3.该法在医学科研中的应用及内参的设置 ?-actin, GAPDH * （二）原位PCR 固定组织或细胞 蛋白酶K消化处理 PCR扩增 原位杂交 显微镜观察结果 基本方法 * （三）重组PCR 定义：使两个不相邻DNA片段重组在一起的PCR 基本原理：将突变碱基、插入或缺失片段、或一种物质的几个基因片段均设计在引物中。先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。 产物：一重新组合的DNA。 用途：位点专一碱基置换、DNA片段的插入或缺失DNA片段的连接(如基因工程抗体)。 * （四）不对称PCR 使用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。 一对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1。 最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。 本法的关键：控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比例。 * （四）不对称PCR 另一种方法： 用等浓度的引物PCR扩增，制备双链DNA(dsDNA)，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备ssDNA。 本法制备的ssDNA，主要用于DNA测序。 * （五）多重PCR * （六）反向PCR 用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段。 * （七）锚定PCR：适用分析一端序列未知的基因片段 锚定引物多聚核苷酸的长度需大于12bp。 为克隆操作方便，其5‘端可增加内切酶识别位点或其他序列信息。 可以提高可以提高PCR的效率和特异性。 （八）巢式PCR（嵌套式PCR） * （九）实时PCR （real time PCR） 又称荧光定量PCR，是近年来发展起来的一种新的核酸微量分析技术 特点：精确度高、结果明确、能进行高通量 分析、操作容易 * 实时PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过外标准对样品中的DNA (or cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。 对于一个实时PCR来说，引物的大小、位置、纯度及扩增反应效率等要求比之普通RT-PCR来说要相对严格的多，具体引物设计原则大致有： ①引物的长度通常为17-25nt（不宜过长或过短）； ②扩增片断长度一般为80-150bp（最好控制在300bp以内）；③引物序列的GC含量最好介于40％－60％，两条引物的Tm值最好接近； ④引物内部或两条引物之间避免出现3个碱基以上的互补（3