第5章植物离体快速繁殖和脱病毒技术.ppt

5.1 植物的快速繁殖技术 1、快速繁殖的一般技术 无菌培养物的建立 培养物的增值 诱导生根 试管苗的驯化 移栽 初代培养：离体植物的第一次培养。 包括了：外植体的选择和消毒，培养基的筛选和灭 菌，以及接种。 （1）保证无菌 （2）条件合适 （3）技术过关 （4）防止褐变 褐变的原因 影响褐变的因素极其复杂，随着植物种类、基因型、外植体的部位及生理状况等的不同，褐变的程度也有所不同。 ①与基因型有关 不同植物与品种之间褐变现象是不同的，有人把此归结为基因型的不同。一般来说植物材料中单宁类和多种羟酚类化合物的含量高，易引起外植体材料的严重褐化。多数木本植物比草本植物易引起褐化，多年生草本植物比一年生草本植物易引起褐化。 ②与取样外植体的年龄有关 通常幼龄部位产生褐化较轻，随着组织的老龄化含醌类物质增多而褐化加重。因此，在外植体接种时常需要剥去鳞片和大叶片，尤其是以切取幼嫩的芽尖或切取顶芽分生组织(或带少量叶原基)接种更为理想。 ③与外植体取材时间有关 一般在春夏季，尤其是春季采取生长旺盛的外植体产生褐化较轻，已木栓化或木质化的枝条和处于休眠状态的芽作为外植体时褐化严重。即分生部位接种后形成醌类物质少，而分化的部位则形成醌类物质较多。 ④与培养基有关过 高的无机盐浓度会引起棕榈科植物外植体酚的氧化，低盐培养基，尤其是Mn2+和 Cu2+离子浓度较低时，外植体的褐化程度较轻。例如油棕用MS无机盐培养容易引起外植体的褐变，而用降低了无机盐浓度的改良MS培养基时则可减轻褐变，而且获得愈伤组织和胚状体。 植物生长调节物质使用不当时，材料也容易褐变，细胞分裂素BA有刺激多酚氧化酶活性提高的作用，这一现象在甘蔗的组织培养中十分明显。 培养基的PH值较低时常有利于减轻外植体的褐化。 一般在液体培养基和半固体培养基上褐化程度比在固体培养基上轻。 ⑤培养条件不适宜 如温度过高、光照过强、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。在咖啡组织培养中曾观察到这一现象。 ⑥材料转移时间 过长也会引起材料的褐变，以致全部死亡。 褐变的防止措施： ①选择适宜的外植体及最佳培养基 许多成功的经验表明，选择适当的外植体并建立最佳的培养条件是防止外植体褐变最主要的手段。外植体材料应有较强的分生能力，在最适宜的细胞脱分化与再分化的培养条件下，使外植体处于旺盛的生长状态，便可大大减轻褐变。 在培养条件的许多因子中，较为重要的是适宜的无机盐成分、适宜的蔗糖浓度及激素水平。适宜的温度及在黑暗条件下进行培养也可显著减少材料的褐变。如能在初始培养的1—6周内用暗培养，或在150lx左右的光强下进行光培养，可抑制酚类物质氧化。 ②连续转移 对于易褐变的材料进行连续转移可以减轻醌类物质对培养物的毒害作用。在无刺黑莓的茎尖培养中，接种后1—2d就转入新鲜培养基；在山月桂树的茎尖培养中，接种12—24h便转入液体培养基，然后继续每天转移1次，连续7天，褐化便得到了完全控制。 ③加抗氧化剂 在培养基中加入抗氧化剂，或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养，可预防醌类物质的形成。抗氧化剂包括抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和牛血清白蛋白等。在静止的液体培养基中加入抗氧化剂比在固体培养基中加入抗氧化剂，效果要明显得多。在倒挂金钟茎尖培养中加入0.01％PVP便对褐变有抑制作用。 ④加活性炭 1％～0.5％的活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显。在许多热带树木的组织培养中均曾观察到活性炭防止外植体褐变的明显效果。 （5）玻璃化及预防 植物组培玻璃化苗的叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状；整株矮化肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。 玻璃化苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难成活，严重影响组培苗繁殖率的提高。 玻璃现象及其产生原因 玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。 ①激素浓度 激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高(或细胞分裂素与生长素比例高)，易导致玻璃化苗的产生。产生玻璃化苗的细胞分裂素浓度因植物种类的不同而异。 细胞分裂素的主要作用是促进芽的分化，打破顶端优势，促进腋芽发生，因而玻璃化苗也表现