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质粒DNA中量试剂盒说明书 产品组成 质粒DNA中量试剂盒 Cat. No. 25次制备 1010025 过滤器 核酸纯化柱 RNase A Buffer I Buffer II Buffer N3 Buffer W2（浓缩液） Buffer E 说明书 25套 25套 260 μl 130 ml 130 ml 130 ml 80 ml×2 60 ml 1份 产品储存 RNase A可室温运输，收到产品后请将RNase A和Buffer ETR置于2~8℃贮存。加入RNase A的Buffer I请置于2~8℃贮存。如果Buffer I储存时间超过6个月，需补加RNase A至终浓度为100 μg/ml。 其他试剂与物品如果储存于室温（15~25℃），可在两年内保持使用性能无明显变化；如果将产品储存于2~8℃，可延长产品的有效期至两年以上（2~8℃储存的产品使用前应先使产品恢复到室温后再使用）。 技术支持 杭州新景生物试剂开发有限公司研发部：e-mail: technical@, 电话：400-0099-857。 产品介绍 本试剂盒采用碱裂解法抽提质粒及核酸柱纯化技术开发而成，适合于从40～80 ml细菌培养物（LB培养基）中提取多至500 (g的质粒DNA，适用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、转化、真核细胞转染、基因治疗、DNA疫苗等分子生物学实验。 用户需自备的试剂与物品 无水乙醇 50ml离心管、2 ml离心管、移液器及吸头 一次性手套、纸巾及防护用品 可使用50 ml离心管及2ml离心管的离心机 旋涡振荡器、水浴锅、恒温培养箱 可能需要异丙醇、70%乙醇、3?M?乙酸钠(?pH?5.2) 使用前准备 如果离心机有制冷功能，请将温度设置到25℃。 将恒温培养箱设置到37℃。 向装有RNase A的螺旋盖管中加入1ml Buffer I，混匀后再将溶液吸回到装有Buffer I的瓶子中，并在标签的方框中打勾作好“RNase A已加”的标记，置于2~8℃保存。 根据试剂瓶标签上的指示在Buffer W2中加入无水乙醇，并在标签的方框中打勾作好“乙醇已加”的标记。 当室温低于15℃时，使用Buffer II前应先观察试剂是否有白色沉淀产生，如有沉淀则应于37℃水浴直至沉淀溶解后再使用。 操作步骤： 1）用自备的50 ml离心管收集40~80 ml过夜培养的细菌培养物（若使用丰富培养基，菌液体积应减半或更少），将离心管倒置于纸巾上 1min，除尽上清。 2）加入5 ml 已加入RNase A的Buffer I 悬浮细菌沉淀。 *可用旋涡振荡器振荡或用移液器多次吸打的方法悬浮沉淀的细菌块。充分悬浮的细菌呈均一的悬浊液，不应留有可见的小菌块，否则将严重影响最后质粒的产量。 3）加入5 ml Buffer II，温和并充分地上下翻转6-8次混合均匀，使菌体充分裂解。 * 使用Buffer II前确认溶液中没有可见沉淀存在；Buffer II使用完后应盖紧瓶盖，避免与空气长期接触。 * 此步骤不可用旋涡振荡器混匀，否则将导致最后制备的质粒中混有基因组DNA。 * 当细菌裂解充分时，溶液应呈粘稠的半透明状；如果达不到上述效果，可能因细菌用量过多所至，可增加翻转的次数以达到细菌充分裂解的效果。注意此步骤不应超过5分钟。 4）加入5 ml Buffer N3，温和地翻转离心管直至溶液中残留的蓝色沉淀全部转变为淡黄色沉淀，将中和产物全部倒入过滤器中，盖上管盖，≥4,500×rpm 离心2分钟。 * 此步骤不可用旋涡振荡器混匀，否则将导致最后制备的质粒中混有基因组DNA。 6）弃过滤柱，在滤液中加入6.5 ml异丙醇，盖紧管盖，温和地上下翻转10次混合均匀。将混合液倒入核酸纯化柱中，盖上管盖，≥4,500×rpm 离心2分钟。 7）弃离心管中滤液，将核酸纯化柱置回到50ml 离心管中。向核酸纯化柱中加入 20 ml Buffer W2，盖上管盖，≥4,500×rpm 离心2分钟。 * 确认在 Buffer W2中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 8 ) 弃离心管中滤液，将核酸纯化柱置回到50ml离心管中，开盖，≥4,500×rpm 离心15分钟。 * 如果离心机的最高速可达10,000×rpm以上, 可将离心条件更改为≥10,000×rpm 离心5分钟。 9）弃50ml离心管，将核酸纯化柱置于一个洁净的50 ml离心管（自备）中，开盖，恒温培养箱中37℃静置10-15分钟。 * 此步骤是为了去除纯化柱上残留的乙醇，如果此步骤结束后，核酸纯化柱中还能闻到乙醇味，应适当延长静置时间。 10）在纯化柱的膜中央加入2 ml Buffer E，开盖，室温静置5分钟，≥4,500×rpm 离心5分钟。 * 勿用小于2 ml的Buff