试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理上海交通大学医学院医学.ppt

蛋白质分离技术-电泳 上海交通大学医学院 倪培华 副教授 概 述 凝胶电泳：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。 特点： 1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。 2. 电泳操作方法简便，电泳速度快 3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。 4. 适用于生化，免疫等定性定量测定 琼脂糖 半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷 琼脂糖凝胶的特点 （一）优点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6.有热可逆性 （二）缺点 1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 4.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 应 用 1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化 2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测 3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标 ? 琼脂糖凝胶电泳分离血浆脂蛋白 原理 血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。 (一)血清脂蛋白(lipoprotein)的组成 ApoA ApoB 蛋白质：即载脂蛋白 ApoC ApoD ApoE 甘油三酯 （TG） 脂类 磷脂 （PL） 游离胆固醇 （FC） 胆固醇酯 （CE） 少量糖 （二）分类 1. 按电泳法分 ?? 乳糜微粒（chylomicron,CM） ??? ?-脂蛋白 （?-位） ??? 前?-脂蛋白（?2-位）） ?-脂蛋白 （?1-位） 2. 按超速离心法分 乳糜微粒(chylomicron,CM) ( 0.96 ) 极低密度脂蛋白 (0.96?1.006) (very low density lipoprotein, VLDL) 中间密度脂蛋白 (1.006?1.019) (intermediate density lipoprotein, IDL) ? 低密度脂蛋白LDL(1.019?1.063) (low density lipoprotein, LDL) 高密度脂蛋白HDL(1.063?1.21) (high density lipoprotein, HDL) ? （三）结 构 特 征 pH 8.6 pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。 临床应用：高脂蛋白血症的分型 CM β 前β α 正常 Ⅰ型 Ⅱa型 Ⅱb型 Ⅲ型 Ⅳ型 Ⅴ型 操作 正常参考值（百分比） α-脂蛋白 30-40% 前β-脂蛋白 15% β-脂蛋白 55% 复习思考题 名词解释 1.迁移率 2.电渗 3.电泳 问答题 1.影响电泳迁移率的因素有哪些？ 2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。 注意事项： ①血清样品要新鲜； ②为了免去离心步骤，吸取预染血清时，应吸取上层，下层或管底可能有染料颗粒沉渣，否则应再离心后吸预染血清。 * * 琼脂糖凝胶 天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉 从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。 琼脂糖（agarose） 琼脂胶（agaropectin） Acid sulfate Carboxylic acid groups 在电场作用下能产生较强的电渗现象 琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。 D-半乳糖 3，6-脱水-L-半乳糖  少 少 多 多 小 高 快 不规则 规则 多 多 少 少 大 低 慢 甘油三脂 胆固醇 蛋白质 带电量（Q）pH8.6为例 颗粒大小（mm） 密度 电泳速度 形态 HDL LDL VLDL CM 加