试验一细菌染色法及微生物的观察海南大学.ppt

环境微生物学实验 本课程是环境科学、农业资源与环境等专业开设的一门独立的专业基础课实验 ,其宗旨是着重训练学习掌握微生物学最基本的操作技能，如显微镜的使用方法，微生物的基本形态观察，细菌染色技术，土壤、水体、空气中微生物的检测等。了解微生物的基本知识，通过观察具体材料和实验结果以加深理解和巩固课堂讲授的某些环境微生物学理论；同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力。本课件的内容主要包括：荧光原位杂交法检测活性污泥中的硝化细菌、微生物的接种技术、细菌染色及微生物观察，土壤、空气微生物检测、水体中大肠菌群细菌的检测等。 实验一细菌染色法及微生物的观察 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等)使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料．如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G－)和革兰氏阴性菌(G＋)两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G－菌和G＋菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G－菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G＋菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 一、实验目的和内容 目的：巩固无菌操作技求，掌握细菌及其结构的染色技术。 内容： 1、学习细菌单染色操作技术。 2、学习革兰氏染色技术。 3、学习细菌的荚膜、芽孢及鞭毛染色方法。 二、实验材料和用具 1、单染色法： （1）大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的斜面菌种。 （2）吕氏美蓝染色液、石炭酸复红染色液、黑色素液或碳素墨水、香柏油、二甲苯、无菌水 （3）显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签。 2、革兰氏染色： （1）黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌（E.coli）菌液，待测菌菌液l～2种； （2）??革兰氏染色液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95％乙醇、石炭酸复红液等)、 （3）?香柏油、二甲苯；显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。 3、荚膜染色： (l)在阿须贝(Ashby)无氮培养基上培养3—5天的团褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)或者培养2—3天的硅酸盐细菌(Bacillus mucilaginosus subsp silicus) (2)李夫森氏染色液、硼酸钠美兰染色液、石炭酸复红染色液、黑色液。 (3)载玻片、接种环、洗瓶。 (4)显微镜。 4、鞭毛染色： (1) 在牛内膏蛋白胨斜面上培养19—24小时的假单孢菌(Pseudomonas.sp)，此培养体在取用前经过每日移植—代，连续移植5～7代。 (2)新配制的费氏及康氏鞭毛染色液A和B。 (3)无菌水、无菌空试管、凹玻片。盖玻片、洁净载玻片、接种环、洗瓶。 (4)显微镜． 5、芽孢染色： (1)在牛肉膏蛋白胨斜面上培养24～36小时的枯草杆菌或者苏云金杆菌。 (2)载玻片、接种环、酒精灯、洗瓶、镊子。 (3)显微镜。 (4)香柏油、二甲苯、擦镜纸． (5)孔雀绿染色液、蕃红染色液。 三、操作步骤 一、单染色法 （1）涂片 在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水（图4－10a），用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2（图4－10b）。 （2）干燥 将涂片于室温中自然干燥。 （3）固定 手执载片—端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏(图4—10c)。 （4）染色 将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min(图4—10d)。 （5）水洗 倾去染色液，斜置