第五章：质谱法测定分子结构（二），大分子.ppt

仪器 鉴定率 肽质量指纹谱 MALDI ~50% (Peptide Mass Fingerprinter, PMF ) 多肽序列标签 LC/MS/MS ~80% (Peptide Sequence Tag, PST) 从新测序 LC/MS/MS 80% (De Novo) 蛋白质及混合物的定量分析： 同位素编码亲和标记 (Isotope-Coded Affinity Tags, ICAT) 蛋白质序列研究的三个层次 蛋白质组研究技术路线 样品(组织、细胞等) 凝胶图象分析 蛋白质鉴定 二维数据库 酶解 HPLC-MS、MS/MS 数据库检索 二维凝胶电泳 酶解 肽混合物 MS、MS/MS 肽指纹谱 肽序列标签 从新测序 一、肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinter, PMF) PMF测定速度快。 PMF灵敏。 PMF需要完整和准确的蛋白质序列数据库。 分离的酶解的蛋白质 96/384位样品靶 数据处理和数据库检索 质谱样品的准备 MALDI质谱分析 蛋白质一级结构结果 PMF方法的一般流程 洗胶/去污 脱水 减少S-S键 洗涤/脱水 1、In-gel 酶切/消化 Multiprobe (4x96 Well Plat) 样品体积0.5-100 ?L 板上加热和冷却 消化板加热 37oC 肽存储在-4oC冷却板 酶试剂存储在-4oC冷却板 修正-SH基 加入trypsin溶液 5-12小时 肽提取 2、质谱分析样品的制备 灵敏度： 500fmoles BSA in-gel。 移液和消化时间8小时(1x96 well plat)。 最多可进行4x96 well plat的同时消化。 基本能力 3、质谱测定 设这检索的条件，不同软件有不同的参数和用法。 MALDI-TOF 质谱测定 4、数据库检索 15 17 11 Number of peptide used in search 1 1 1 Number of missed cleavages 5 5 5 Mumber of peptides Monoisotopic Monoisotopic Average Pepptide masses are Carbamidomethylation(Cys-CAM) Cysteine is Oxidized Oxidized Oxidized Methionice is ±0.5Da ±0.5Da ±2Da Peptide mass accuracy Trypsin Trypsin Trypsin Digest used MAMMALS MAMMALS MAMMALS Specie searched 15~45kD 15~45kD 20~50kD Protein mass range 3.7~7.7 3~7 NO pI range PeptIdent PeptIdent MS-Fit Program used 样品-3 样品-2 样品-1 参数的选择 parmeters 样品1 样品2 样品3 数据库检索结果： 带*号的峰为与数据库中的峰相匹配的峰。 样品1：甘油醛-3-磷酸脱氢酶 样品2：遍在蛋白羧酸基末端水解同工酶 样品3：丙糖磷酸异构酶 1、远电荷碎裂的主要反应机理 长链饱和化合物 1,4氢消除反应 (1) 两步均裂反应 (2) 产生荷基异位离子 末端不饱和离子 长链不饱和化合物 (a) 近烯丙基键，记作Ap断裂， Proximal allyl bond。 远烯丙基-乙烯基键 distal allyl–vinyl bond, Avd 近烯丙基-乙烯基键，记作Avp断裂， proximal allyl–vinyl bond。 X = O+ 或 OLi2+。 13-羰基-十八烷酸，12-羰基-十八烷酸的远电荷碎裂谱图 十八烷酸CID-MIKES谱图，[M-Ht2Li]+ (A) 4,7-二烯十八烷酸, m/z 293 (B) 6,9-二烯十八烷酸 m/z 293 高能碰撞, 6kV 给出较多的信息，常用的远电荷碎裂的方法。 长链脂肪酸[M-H]+离子的ES-MS/MS 谱图 (a) 硬脂酸， m/z 283; (b) 油酸, m/z 281; (c) 亚油酸, m/z 279. 谱图采自于AutoSpec-OATOF仪器。碰撞能量400eV，Xe用作碰撞气体。