肿瘤治疗药物诱导细胞凋亡的研究教材教学课件.ppt

生物科学与工程系细胞生物学实验教学研究室 大连理工大学 环境与生命学院 流式细胞技术检测肿瘤治疗药物诱导的细胞凋亡 1. 实验目的 了解细胞凋亡、及流式细胞技术原理等基本知识。 学习细胞凋亡的形态学观察和流式细胞术检测的方法。 学习流式细胞技术标本的制作方法,了解流式细胞仪的使用。 2.实验原理 2.1 细胞凋亡的基础知识 2.2 流式细胞技术的一般原理及应用 2.3 用流式细胞术检测细胞凋亡的原理 2.1 细胞凋亡的基本知识: 定义:细胞凋亡是细胞在一定程序控制下的自主死亡过程。细胞凋亡同细胞分裂、细胞分化一样是机体生存和发育离不开的最基本的生物现象,通过凋亡可以平衡机体内细胞的数目,清除衰老、过剩、有害的细胞。细胞凋亡异常会引起免疫性疾病或肿瘤等。 (一)、细胞坏死 是细胞受到急性强力伤害时立即出现的反应。 早期表现为细胞膜破坏,线粒体肿胀。 继而溶酶体破裂,细胞内容物流出, 引起炎症。 细胞凋亡与坏死的区别 细胞凋亡与坏死的区别 (二)细胞凋亡cell apoptosis Kerr( 1972)最先提出,与细胞坏死的区别是: ①细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体; ②凋亡小体内有结构完整的细胞器; ③不引起炎症; ④线粒体无变化,溶酶体活性不增加; ⑤内切酶活化,DNA有控降解,凝胶电泳图谱呈梯状; ⑥凋亡通常是生理性变化,而细胞坏死是病理性变化。 细胞凋亡与坏死的区别 胸腺细胞 正常 凋亡 散射光信号 FALS Sensor Laser 散射光信号 Right Angle Light Detector ? Cell Complexity SSC Forward Light Detector ? Cell Surface Area FSC Incident Light Source 前向角散射光(FSC, Forward Scatter) 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光(SSC, Side Scatter) 细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性 外周全血细胞散射光双参数点图(红细胞溶解后) 流式细胞仪的检测信号 荧光信号 使用荧光标记的单克隆抗体染色,做多色分析 荧光信号的强弱,反映了细胞抗原的表达含量 荧光信号 双色直接染色 数据分析 数据存储: LIST MODE 数据显示: 直方图 ( Histogram ) 二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图 (Density) 三维图(3D Plot)等 数据分析 直方图分析 数据分析 点图分析 数据分析 等高图和密度图分析 2.3 用流式细胞术检测细胞凋亡的原理 利用流式细胞仪测定细胞光散射可对凋亡细胞进行分析。凋亡早期细胞因体积减小,胞浆及染色质固缩,FSC变小,SSC增大,凋亡晚期细胞FSC、SSC均变小,坏死细胞则因细胞膜通透性改变,细胞肿胀,FSC、SSC变大,胞膜破裂,胞内含物释出后FSC、SSC均变小。 用流式细胞仪也可以根据DNA含量不同,从细胞群体中鉴别凋亡细胞。凋亡细胞在G1峰前出现亚二倍体峰,即凋亡峰(Ap峰)。通过此峰下的面积值可得出凋亡细胞在所测细胞群中所占的比率(用凋亡软件定量)。 另外,细胞凋亡受基因调控,有赖于某些蛋白质的合成,用流式细胞仪可同时测定凋亡细胞的FSC/SSC及DNA/蛋白质,进行多参数分析以研究不同的凋亡诱导作用机制。 3.实验材料、用品 实验材料:培养的Hela细胞 实验用品: ①仪器与用具 C02培养箱,超净工作台,倒置显微镜和离心机等。 微量加样器(1μl-1ml),0.5 ml和1.5 ml的Eppendorf管,20μl、200μl和1ml吸头,10ml培养瓶,载玻片,盖玻片等。 ②试剂 放射线菌素D(诱导细胞凋亡的肿瘤治疗药物,如喜树碱、紫杉醇、中药砒霜等);荧光探针:用PBS(pH7.4)将PI配成500 μg/ml的贮液,在-20℃冻存。 FACSCalibur, BD Bioscience 4.实验步骤 Hela细胞的传代培养 诱导细胞凋亡:向对数生长期细胞中加入放射线菌素D(可结合科研采用其他诱导细胞凋亡的肿瘤治疗药物)分别为0.25、0.5、1、2、4mg/L, 作用6小时。 用胰酶消化以上五个样本以及对照的细胞,吹打收集于离心管中,1000r/min下离心8分钟,倒去上清。 加约1ml PBS重悬细胞,用注射器迅速注入到4ml4℃的70%的酒精中,固定8小时以上。 去上清,用PBS 4ml重悬细胞,再1000r/min下离心8分钟,去上清控干液体后加0.3mlPBS ,加入RNA酶A至终浓度为50ug/ml,37℃孵育30分钟