重组体克隆的筛选和鉴定内蒙古大学.ppt

2）印迹（Blotting） 原理与ELISA相同。 发光 （或显色） 加一抗 加酶偶联的二抗 加底物 底物 产物 荧光标记的blotting 一、无细胞翻译系统 第六节 转译筛选法 能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。 借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。 适用于mRNA转录丰度高的外源基因。 二、转译筛选 mRNA 无细胞翻译系统 35S标记的甲硫氨酸 翻译 35S标记的肽链 PAGE电泳 放射自显影 载体—外源DNA 转录 与预期的产物分子量相符？ 三、杂交抑制转译法 mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。 单链mRNA 能翻译 mRNA DNA 不能翻译 1. 原理 候选克隆的总mRNA 无细胞翻译系统 杂交 肽链 PAGE电泳 载体—外源DNA 无细胞翻译系统 肽链 目的基因产物的位置 四、杂交释放转译法 候选克隆 的总mRNA 无细胞翻译系统 35S标记的甲硫氨酸 翻译 35S标记的肽链 PAGE电泳 放射自显影 与预期的产物分子量相符？ mRNA 洗涤 载体外源DNA 专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。 五、DNA-蛋白质相互作用筛选法 待测的总蛋白 放射标记的DNA 放射自显影 克隆与筛选的一般策略 制备目的DNA 直接酶切 机械切割 RT cDNA 化学合成 PCR扩增 粘性末端、同聚物尾巴、linker、adaptor 脂质体 转化 噬菌体 TA克隆 插入载体 转入寄住 筛选 基因枪 酶切 杂交 PCR 免疫 抗菌素 表型 脓杆菌 花粉管 电转 第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法 真核细胞中合成核苷酸需要四氢叶酸提供甲基。 一、哺乳动物基因转移的选择标记 1. 胸苷激酶（thymidine kinase, TK） （1）TK选择原理 1）四氢叶酸 dUMP dATP TTP dGTP 四氢叶酸 四氢叶酸 2）氨甲喋啉（Methotrexate） 氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dGTP和dTTP的合成： dUMP? dATP TTP dGTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 4）胸苷酸激酶 胸苷酸激酶可以把培养基中的胸苷（T）合成TTP，补救。 T TK 3）次黄嘌呤 细胞可以利用次黄嘌呤补救合成dATP和dGTP。 dUMP? dATP TTP dGTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 次黄嘌呤 1）HAT培养基： 不能产生TK的细胞株。 野生型TK基因，能产生TK。 2）Tk-宿主细胞 3）载体的选择标记基因 （2）TK选择方案 含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine） TK- TK+ 目的基因 HAT培养基 存活的细胞中带有来自载体的TK+基因 进一步选择目的基因 催化产生四氢叶酸（为核苷酸合成提供甲基）。 2. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） （1） 选择原理 1）二氢叶酸还原酶 二氢叶酸 四氢叶酸 二氢叶酸还原酶（DHFR） 2）DHFR- 细胞 不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。 不能在无核苷酸的培养基中生长。 3）无核苷酸培养基 透析除去血清中的内源性核苷酸。 DHFR- DHFR+ 目的基因 无核苷酸培养基 存活的细胞中带有来自载体的DHFR+基因 进一步选择目的基因 3. 新霉素抗性基因（neor） （1）选择原理 G418是新霉素的类似物，对真核细胞和原核细胞都有毒性。 1）G418（geneticin）培养基 2）新霉素抗性基因--neor 编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活。 真核细胞株均可。 3）宿主细胞 死剂量G418（100-800 ?g/mL）。 G418培养基 （2）选择过程 neor 目的基因 存活的细胞中带有来自载体的neor基因 进一步选择目的基因 由大肠杆菌转座子Tn9编码（真核细胞没有这个基因），催化氯霉素发生乙酰化失活。 氯霉素 CAT 真核细胞株均可。 乙酰氯霉素 4. 氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因 （1）选择原理 2） 宿主细胞 chloramphenicol acetyl transferase 1）CAT基因 在转化的细胞提取物中测定是否有CAT活性。 3）乙酰氯霉素分析方法 多种商业化试剂盒，方法各异。 抗体ELISA，荧光裂解液，放射同位素等。 5. 报告基因（reporter gene) 是一种编码可被容易检测的蛋白质或酶的基因 。 常与目的基因融合表达，以示踪目的基因的表达和位置。 编码荧光蛋白 编码酶（催化显色或发光反应） 常用的报告基