第三章 3酶的分离纯化.ppt

上 样 1、样品处理： 过滤、粘度（稀释，大分子聚阳离子化合物如聚乙酰亚胺或鱼精蛋白硫酸盐沉淀核酸或核酸内切酶处理） pH和离子强度控制（缓冲液交换或透析） 2、上样 上样量 上样方法 流速 排干法 要求较高 液面下上样 注意样品密度 3、洗涤 展开/洗脱技术 1. 洗脱展开法：应用最广泛的一种方法。操作时，先将样品输入色谱柱，随即加入一种不与固定相发生作用的溶剂或几种溶剂的混合物作为流动相冲洗。各组分因与固定相作用力不同而分离，并随溶剂向下移动，最后有顺序地全部流出色谱柱。 分为恒定洗脱法、阶段洗脱法、梯度洗脱法 恒定洗脱：整个过程不改变洗脱剂的组成，适合保留容积差别较大的组分，否则不能很好地分离 阶段洗脱 ：洗脱剂的组成至少改变一次，防止共洗脱，影响分离效果 梯度洗脱：逐渐改变洗脱剂的组成，更有利于分离 A：起始buffer B：极限buffer C: A流出体积V时盐浓度；c1：起始；c2极限； V0：A和B总体积；B,A：横截面积 梯度选择 （1）梯度形状 离子交换，线性梯度，再进一步优化 凸型梯度 利于改善梯度末尾部分分辨率 凹形梯度 利于改善梯度起始阶段分辨率 混合型梯度（计算机） 组分吸附能力相近需要改善分辨率的位点提供足够分辨率 对分辨率不做要求位点采用陡峭梯度 （2）梯度高度和斜率 高度：起始与洗脱终止时盐浓度差值 斜率：梯度的高度与完成此梯度所用洗脱剂体积或 时间比值 低斜率 利于改善吸附能力相近组分分辨率 但导致峰宽加大和分离时间延长 高斜率 可实现快速分离，得到窄的洗脱峰 但组分间分离度差异会减小 结合调整pH等条件提高分辨率 （3）经验 线性梯度 10个柱体积内，盐浓度从零提高至0.5 mol/L或1 mol/L 根据分离图谱，洗脱峰靠近，分辨率不理想部分降低斜率，无洗脱峰部分提高梯度斜率，形成混合型梯度 （4）流速调整 2.前沿分析法 样品连续不断地输入色谱柱，即样品溶液本身起流动相作用。 开始时，溶质全部吸收在固定相内，流出液为纯溶剂，经过一段时间洗脱后，与固定相最弱的A组分首先流出，随后是作用力较强的B物质和更强的C物质，形成3个阶梯，直至稳定不变 A+B+C A+B A A+B A 物质浓度 流出液体积 特点：不能将每个组分都分离回收，只能得到作用力最弱的物质，一般不用于混合物的分离。适合精制中除去痕量杂质，组分浓度不会像洗脱展开那样逐渐稀释。 3.置换展开法 用一种与固定相作用力极强的置换剂作为流动相，去替代结合在固定相表面的溶质分子。最先从柱中置换出来的是作用力最弱的物质，最后是置换剂本身。也为一阶梯图 特点：各组分浓度在展开过程中不但不会降低，有时甚至能提高。不足之处是各组分一个连一个流出，界限不分明。有待改进。 A B 取代剂 流出液体积 物质浓度 BS－100自动部分收集器安装圈 1．反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10．收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13．自动开关；14、指示灯；15.电源开关；16．换向开关（逆、顺）；17．手动开关 一、原理 疏水相互作用层析根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离蛋白。 在纯水中，任何疏水效应都太弱而不能导致配基和蛋白之间或蛋白自身的相互作用缓冲液中的某种盐的存在会显著影响疏水蛋白和疏水层析介质的相互作用。高浓度的盐会增强相互作用，而低浓度的盐减弱相互作用。 疏水相互作用介质是将含有烷基或芳香基团配基偶联到惰性的球形颗粒基质上 第四节 疏水相互作用层析（HIC） 二、常规步骤 1、5-10个柱体积的起始缓冲液平衡柱子，或直到紫外吸光回到基线电导平稳 2、调节样品到选择的盐浓度（如果需要的话调节pH）。过滤，上样到柱子上 3、5-10个柱体积的起始缓冲液冲洗或直到紫外吸光基线电导平稳 二、常规步骤 4、用10-20个柱体积开始洗脱，增加洗脱缓冲液的比例，直到盐浓度达到最低值，就是无盐缓冲液（100% 洗脱缓冲液）。或者，如果没有能够产生梯度的仪器，用最多5倍柱体积的洗脱缓冲液（盐浓度比起始缓冲液的低）洗脱结合的蛋白。重复，在每步降低盐浓度，直到目的蛋白被洗脱下来 5、2-5个柱体积的无盐洗脱缓冲液洗脱任何疏水结合在柱子上的物质 6、用5-10倍柱体积的起始缓冲液平衡柱子，或直到电导达到需要的值 三、盐的选择和缓冲液制备 1、盐 正确选择的盐种类和浓度是影响载量和最终选择性的最重要参数。 目的是优化条件获得需要的选择性结合目的蛋白，确认大多数的杂质都流过柱子 实践中，钠、钾、或铵的硫酸盐有效的促进在疏水相互作用层析中配基-蛋白相互作用，在蛋白质结构上有稳定作用 最常用的盐：硫酸铵，硫酸钠，