DNA的体外重组与转移.ppt

第六章 DNA的体外重组与转移 第一节 重组DNA分子的构建 重组DNA分子的构建需要考虑三个因素 （1）实验步骤要尽可能地简单易行； （2）连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段； （3）外源基因必须在表达载体的启动子下，并置于正确的ORF中，以便目的基因的表达。 2、人工加尾形成 “粘性末端” （1）衔接物（linker）连接 ③优点： （2）DNA接头 (adapter)连接法 三、PCR产物的连接 引物1 引物2 带酶切位点的PCR产物 2、与T载体直接连接 四、DNA体外连接应注意的事项 2、DNA插入的方向正确 3、插入基因的开放阅读框（ORF）正确 4、防止载体自身环化连接 五、载体和外源DNA插入片段的连接结果 受体细胞：能够摄取外源DNA并使其稳定维持、具有应用价值和理论研究价值的细胞。 根据细胞的种类可分为三类： * 原核生物受体细胞 * 植物受体细胞 * 动物受体细胞 1、原核生物受体细胞 特点： 1）染色体裸露，便于外源DNA重组 2）基因组简单，便于进行遗传分析 3）单细胞生物，易于获得一致性受体细胞 4）培养条件简单，生长快，实验周期短 主要的原核受体细胞： 大肠杆菌，枯草杆菌，蓝细菌等 应用 * 保存和扩增目的基因 * 表达基因产物 * 构建基因组文库 2、植物受体细胞 特点： 1）具有体细胞全能性，一个分离的活细胞 在合适的条件下可分化成植株 2）具有坚硬的细胞壁，可以纤维素酶处理 获得原生质体. 应用： 转基因棉花，水稻，玉米，马铃薯，烟草 3、动物受体细胞 特点 1）体细胞一般无全能性，只能分化到细胞株 2）生殖细胞、胚胎细胞等具有全能性，可分 化、培养成转基因动物 应用 转基因羊，鼠，兔，猪，牛，检测动物核酸疫苗的表达等。 一、重组体导入原核细胞 4、制备原理 在0 ℃的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀， Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，增加细胞膜的通透性。 转化时加入DNA后， Ca2+ 能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶的羟基－磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42 ℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙，即可使外源DNA进入细胞内。 5、制备过程 （二）重组DNA导入原核细胞的方法 （1）化学转化（热休克法） （2）电转化法 基本原理： 在一定强度脉冲电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生暂时性缝隙或微孔，质粒或DNA重组分子便可由此微孔进入细胞实现外源基因的转移。 特点： 转化效率高（高于109/?gDNA）。 转化率的用途 影响转化率的因素 ② 感受态细胞 （competent cells） 二、外源基因导入真核细胞 （1）基本原理 将转移的DNA溶液与适量CaCl2的溶液混合，再加入一定量的磷酸盐溶液，逐步生成DNA－磷酸钙沉淀复合物。将适量的该复合物加入细胞培养液中，通过细胞的胞饮作用进入细胞质或进而转移到细胞核内，然后整合到染色体上，或游离于细胞质中逐渐降解。 （2）操作步骤： ①DNA－磷酸钙沉淀复合物的制备 ②沉淀复合物向受体细胞的转移 ③后培养 3、脂质体（lipofectin）介导法 4、DEAE---葡聚糖转染法 （1）原生质体融合法 用酶去除微生物和植物细胞的细胞壁，形成原生质体，将外源基因与原生质体混合，在PEG（聚乙二醇）作用下使外源基因导入细胞。 本章要点 掌握粘性末端连接的优缺点；平端连接的方式及各自的原理和优缺点；PCR产物的连接方法；受体细胞的种类及特点；大肠杆菌感受态的制备的原理及方法；重组DNA导入原核细胞的方法；转化率的含义、用途及影响因素；外源基因导入真核细胞的方式。 作业 将PCR扩增的目的基因定向克隆到pcDNA3.1载体: 设计带有克隆酶切位点的PCR引物，用于扩增目的基因； 选择合适的酶切位点； 确定重组后的表达载体序列。 2. 载体自身环化连接（能存活） 3. 载体之间互相连接（能存活） 4. 插入片段互相连接（不能存活） 5. 一个