[工作计划]大学生创新课题.doc

黄河裸裂尻生长激素基因的PCR扩增和克隆 摘要：从黄河裸裂尻鱼的脑组织提取总RNA，应用RT-PCR方法获得生长激素cDNA。将cDNA 插入质粒 pQE30中,并使其在大肠杆菌 RB791 中表达。经IPTG诱导后SDS电泳检测蛋白的表达情况。结果表明：扩增后黄河裸裂尻生长激素基因为508bp。由序列的比对，黄河裸裂尻生长激素基因与青海湖裸鲤的的同源性很高。电泳结果显示一新的分子量约为14. 4 kD的特异蛋白带。 关键词：黄河裸裂尻 生长素基因 克隆 基因表达 PCR amplification and Cloning of growth hormone gene in Schizopygopsis pylzovi Abstract: The total RNA was extracted from brain of Schizopygopsis pylzovi.The growth hormone cDNA was amplified by RT-PCR method using isolated total RNA as template. The GH cDNA fragment was inserted to plasmid pQE30 and made it expression in E.coli RB791.The expression protein was assayed by SDSafter IPTG inducing . Results show that the GH cDNA fragment of Schizopygopsis pylzovi was 508bp in length. The growth hormone gene of Schizopygopsis pylzovi was highly homologous with the that of Gymnocypris przewalskii according to sequences comparison. The results of electrophoresis showed that a new specific protein band was found with molecular mass of about 14. 4kD. Key words：Schizopygopsis pylzovi growth hormone（GH）gene Clone Gene expression 生长激素(growth hormone,GH)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白激素，它是一种具有广泛生理功能的生长调节素，鱼类生长激素(fish growth hormone,fGH) 是鱼类脑垂体合成和分泌的一种分子量在22 kD左右的蛋白多肽，对鱼类的生长和发育有重要作用。本实验采用RT-PCR方法克隆黄河裸裂尻GH cDNA，进一步获得黄河裸裂尻生长激素基因序列,并将其连接至载体上，构建黄河裸裂尻鱼生长激素基因表达质粒,在大肠杆菌系统进行了高效表达,获得融合蛋白，这对我省开展的高原特有鱼种的人工驯化和养殖计划打下了有力的技术保障。 材料与方法 1.1 材料 将黄河裸裂尻鱼在实验室水池短暂养殖。RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0、pMD 19-T Vector均为TaKaRa公司产品。引物利用Primere 5根据同属鱼类同源性比对设计，其他试剂购自索莱宝公司。 方法 黄河裸裂尻总RNA提取： 参照查阅的文献中的方法从黄河裸裂尻鱼组织中提取总RNA，电泳分析RNA质量，利用分光光度计测定其含量后，储存于液氮中。 引物设计: 利用鱼类GH保守的特点，通过同源性比对设计引物为： GH1： 5 TGAGGAAAGCCTGTTGC 3 GH2：5 TGACTAGCAATACATTAGCG 3 RT-PCR扩增：溶解总RNA于DEPC水中，RNA终浓度为1ug/ul A RT-PCR反应体系如下（表1）： 试剂 用量 Mgcl 2ul 10 * PCR Buffer 1 ul RNase free dH2O 3.75 ul dNTP Mixture 1 ul RNase Inhibitor 0.25 ul AMV Reverse Transcriptase XL 0.5 ul Oligo dT-Adaptor Primer 0.5 ul RNA 1 ul Total 10ul 反应条件： 30℃ 10min 50℃ 20 min 99℃