RACE原理及实验步骤.ppt

Table of Contents SMART技术 First-strand cDNA 合成 5- 3-RACE PCR 另备物品 下列试剂需另外准备： 由于 SMART? RACE cDNA Amplification Kit 没有PCR polymerase，可以使用以下物品： Advantage 2 PCR Kit (Cat.Nos.639206/639207) Advantage 2 Polymerase Mix (Cat.Nos.639201/639202) 二、引物设计 A. 引物序列 特异引物(GSPs) 应当： ? 23–28 个核苷酸 ? GC含量为 50–70% ? Tm 大于或等于65°C，如果Tm 70°C可获得最好的结果 (可 使用降落PCR)。 ? 至少需要两个特异引物才能进行完整的BD SMART RACE：即用于5-RACE PCR的反义引物和用于3-RACE PCR的正义引物。如果只进行5- 或3-RACE则只需一个特异引物。引物长度在23–28个核苷酸，长于30个核苷酸没有优势。模版、引物及RACE产物下图所示。 The relationship of gene-specific primers to the cDNA template. B. 引物在基因上的位置 ? BD SMART RACE Kit得到的扩增产物大于6.5 kb ? 对引物加以筛选，使5-和3-RACE 产物达到2 kb C. 降落PCR ? 明显增加BD SMART RACE扩增的特异性 ? 降落PCR的退火温度符合首次PCR循环的Tm 高于通用引物的Tm 。 ? 退火温度在随后降低到与通用引物相配合的程度，引起特异性基因模版的指数和高效率的扩增。 ? 当引物的T m70°C时建议使用降落循环程序。 D. 巢式引物 在首次试验时，不要使用巢式PCR。混合的通用引物（UPM）和基因特异引物（GSP）通常能得到较好的低的非特异性背景的RACE产物。但是，巢式特异引物可以作为探针在鉴定RACE产物的Southern blotting中使用。 此外巢式PCR在使用特异引物进行5- or 3-RACE存在高背景或高非特异性扩增时有必要使用。在巢式PCR中，使用外侧引物进行一个初步的扩增，如果扩增产物模糊不清，可以使用内部引物重新扩增初步产物的一部分。BD SMART RACE 指南包括了可选的步骤，指明了巢式引物能够被使用的地方。本试剂盒提供的通用巢式引物A 可用于5- and 3-RACE。按照上述指南可以设计巢式特异引物。巢式引物与外侧特异引物尽可能不重叠，如果因序列有限而必须重叠，其内部引物的3末端的序列也要尽可能唯一。 中文名称：巢式引物 英文名称：nested primer 定义：为巢式聚合酶链反应所设计的引物，第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的。 推荐使用变性甲醛琼脂糖电泳检测RNA 样品。哺乳动物的总RNA 展示为两条4.5 和1.9 kb的带，分别对应28S 和18S 核糖体RNA，它们之间的亮度比率约为1–2:1。哺乳动物的Poly A+ RNA 会产生0.5–12 kb 的弥散带，亮度较核糖体RNA带弱。 四、 3-RACE、5-RACE基本原理 经典的RACE技术是Frohman等（1988）发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5和3端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点。 对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进： 在5 端加尾时，采用poly（C），而不是poly（A） 利用mRNA的3末端的poly（A）尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo（dT）30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA.然后用一个基因特异引物GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3 末端的DNA片段扩增出来。 SMARTTM 5-RACE的原理 先利用mRNA的3末端