RNA干扰及应用.ppt

RNA干扰及其应用 一.RNA干扰的简介 RNA干扰作用(RNA interference，RNAi）双链RNA (double．stranded RNA，dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(post transcriptional gene silencing, PTGS)。 2002 《Science》杂志评为“2002年的重大突破” 2006 Nobel Prize in Physiology or Medicine 二.RNAi发现史 1990, Jorgensen et al 材料：petunias 目的：得到紫色更深的花; 方法：构建强启动子的苯基苯乙烯酮合酶表达载体，导入 牵牛花; 结果：花变得更白; 分析：内源和外源的苯基苯乙烯酮合酶基因的表 达都被抑制,称之为共抑制(cosuppression). 1995, Guo Su et al 材料：c．elegans 目的：消除线虫第一次分裂的不对称性 方法：利用反义RNA技术抑制par-1的表达。对照注入正义RNA。 结果：两种方法都抑制par-1基因。 分析：无法解释。 1998，Fire et al 材料： c．elegans 目的：消除线虫第一次分裂的不对称性 方法：注射纯化的由T4和T7-RNA聚合酶体外转录得到的ss-RNA; 注射纯化的ds-RNA 结果：前者只引起微弱的抑制作用；后者却得到比前者高两个数量级的抑制效果。 分析：RNA Interference(RNAi), Nature,1998,391:806-811 Su Guo等 正义RNA抑制 反义RNA技术的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量dsRNA而引起。 该小组把dsRNA对内源基因的抑制作用称为RNAi。 真核生物：真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等。 RNAi在不同物种的表现形式：植物中的转录后基因沉默、共抑制及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制现象。 三.RNAi作用机制 起始阶段 长dsRNA→siRNA 21-23nt ATP, RNaseⅢ特异核酸酶(Dicer,果蝇) 3’端均有2～3个突出的核苷酸 RISC siRNA→RISC (RNA—induced silencing complex) ATP 活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。 模板：靶mRNA切割片段 引物：siRNA 产物：长链dsRNA 依次循环： 新合成的长链dsRNA同样可被Dicer切割、降解生成大量的次级siRNA。次级siRNA又可进入合成一切割的循环过程，进一步放大RNAi作用。 重要特征： 只对exon有效，对intron和promoter无效，尚未发现对染色体DNA有影响 RNAi具有很高的特异性 放大性 RNAi的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持 对抗由转座子和重复序列引起的不稳定性 对抗病毒等外源性物质的侵入 内源基因调控:探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗 由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，因而RNAi成为研究基因功能的很好的工具。 Zimmermann等人对为猕猴的阿朴脂蛋白B (ApoB)编码的基因施用siRNA，成功降低ApoB蛋白、血清胆固醇和低密度脂蛋白的水平。 这是首次在非人类灵长类动物中有关RNAi的全身用药，是RNAi在药物治疗方法上的重要进展。 同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列，设计针对这一区段序列的dsRNA分子引发RNAi，那么只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除，为单个或多个基因相互作用导致的疾病提供新的治疗前景。 RNAi是机体中古老而天然的抗病毒机制。目前利用RNAi抗病毒感染的研究已经展开，主要集中在肝炎病毒、HIV病毒。 RNAi转基因小鼠,运用RNAi技术，设计针对c-myc基因的siRNA可以有效地干扰K562细胞中c-myc的表达，并进一步诱导细胞凋亡 。 利用RNA干扰成功构建针对突变p53的RNA干扰载体，此干扰载体可以有效降低p53蛋白表达水平，导致突变p53基因沉默，进而延缓PLC／PRF／5细胞生长速度，阻滞肿瘤细胞停滞于G1期。 RNAi可用来研究细胞信号转导通路和细胞生长分化过程。 Clemens等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素的信号转导通路，证明RNAi技术较传统的转染实验