血管内皮祖细胞（EPC）与自体骨髓干细胞移植.ppt

拟胚体的分化种植 将Day4的EB直接种植，采用分化培养基培养，6小时内即贴壁生长，24h后可见从贴壁生长的EB周围出芽样长出梭形或多角形细胞，向外放射状生长，并与周围集落融合。 EB Day4，×400 Day1，×200 Day2，×100 Day4，×100 Day9，×100 Day15，×100 分化细胞的鉴定 DiI-Ac-LDL摄取实验：P9 P9，×400 分化细胞的鉴定 DiI-Ac-LDL摄取实验：L929（阴性对照） ×400 分化细胞的鉴定 荧光双染： DiI-Ac-LDL摄取及FITC-UEA-1 P1，×400 分化细胞的鉴定 免疫组化染色：CD31 空白对照，×400 P15，×400 分化细胞的鉴定 免疫组化染色：Flk-1 空白对照，×400 P15，×400 分化细胞的鉴定 流式细胞仪检测： CD31阳性细胞比例逐渐增加，第2代（P2）时即可达71.7%~82.4%（平均76.6%），P6时则达84.8%~90.1%（平均86.1%），不断传代后最终维持在90%左右的较高水平。 P2 P6 P9 分化细胞的鉴定 透射电镜检测： 分化产生的细胞胞质内细胞器丰富，核周有散在的粗面内质网和丰富的糖原颗粒，线粒体甚为丰富。 分化细胞的鉴定 透射电镜： 细胞膜下及胞质内常见大小不等的吞饮小泡及多泡小体。 分化细胞的鉴定 透射电镜： Weibel-Palade（W-P）小体，是位于胞浆内的棒状呈束的微管，周围有单层膜包被。 结论（2） 采用简单的贴壁培养，单独采用VEGF即可成功诱导小鼠胚胎干细胞分化产生内皮样细胞。 经传代培养后，分化细胞中CD31阳性细胞可达到90%以上，纯度高。 EPC的临床应用与骨髓干细胞移植 血管新生（neovascularization）有三种方式：血管生成（angiogenesis）、血管发生（vasculagenesis）和动脉生成（arteriogenesis） 血管生成是指通过血管内皮细胞迁移、增殖，在原有的血管上以出芽的方式生长出新的血管；血管发生是指在原来没有血管系统的情况下，通过EPCs和造血干细胞产生血流的新通道 传统观念认为vasculagenesis仅和angiogenesis共存于胚胎发育时期，而不参与出生后的血管新生。正是1997年Asahara等首先报道了“出生后血管发生（postnatal vasculagenesis）”，才使这一观念得以纠正 目前认为：vasculagenesis和angiogenesis不仅共存于胚胎发育时期，而且还参与出生后的血管新生 图 2 血管生成和血管发生 EPC参与出生后诸多的生理过程 补充血管壁脱落的EC 女性子宫和卵巢的周期性变化都有血管发生的参与 转基因小鼠的系统研究证明 ，在脑、肺、肝、肠、皮肤及肌肉的血管中都整合有一定的转化细胞，在排卵期的黄体和子宫内膜上尤为明显 EPC的临床应用与骨髓干细胞移植 EPC参与了出生后诸多的病理过程 肢体缺血 心肌梗塞 肥胖相关疾病：Ⅱ型糖尿病、高血压、高血脂 糖尿病视网膜病变 肿瘤 动脉粥样硬化 EPC的临床应用与骨髓干细胞移植 治疗性血管发生（therapeutic vasculogenesis） 1999年，Isner等首先提出了“治疗性血管发生”的概念 倡导以提高补充EPC数量来增加血管生长因子的作用底物，达到更好的血管新生效果，治疗缺血性疾病 这一疗法充分利用成年机体血液循环中存在EPC、EPC对缺血组织的自动趋化能力和归巢能力、EPC能分化形成血管的生物学特性，可以说是一个生理加强疗法。 EPC的临床应用与骨髓干细胞移植 治疗性血管发生 治疗肢体缺血（图3） EPC功能分类 Early EPC:来源于CD14+细胞 Late EPC:来源于CD14-细胞 Mukai N，et al.Experimental cell research 2 0 0 8 ，3 1 4 ： 4 3 0 – 4 4 0 治疗肢体缺血 大量的动物实验表明，外源EPC有助于缺血肢体模型的血管化 hintani等用家兔下肢缺血模型研究，经血管造影、激光多普勒、缺血组织切片毛细血管密度观察，发现细胞移植组侧支血管形成及血管新生均有明显改善 Crosby等用有基因组标记的转基因小鼠的胎肝细胞移植经射线照射的小鼠，随后在小鼠背部皮下植入小海绵，4周后取出海绵和一些未损伤的皮肤、动脉和脑标本制成切片。计数切片中总的内皮细胞，发现海绵中来源于供体EPC的内皮细胞占总内皮细胞数的8.3%-11.2%，而在正常组织中只占0.2%-1.4% 治疗急性心肌梗塞 心梗后坏死心肌不能停止疤痕化，存活心肌代偿性肥大、左心室结构重排，即“心室重建”，最终发展为心衰 EPC治疗