观摩课件（RACE法）.ppt

§2.RACE法分离目的基因 RACE（Rapid-Amplification of cDNA Ends)即cDNA 末端的快速克隆，是80年代末发展起来的，经典方法是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后，用PCR技术得到从基因内部某个特定位点到到3或5 端之间未知序列的方法。 一.基本原理 1.3-RACE 3.5和3 序列的电子合并 去掉5 和3 重复序列，把5 和3 序列进行合并。用DNAman软件和登录GenBank分析序列的正确性。如果正确，可以登录NCBI进行注册。 4. 优点： 1.操作简便:相当于普通的RT-PCR. 两步即可完成不需要额外的 cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应. 2.大大提高了获得全长cDNA的几率:逆转录酶以mRNA为模板合 成cDNA，在到达mRNA的5末端时碰到真核mRNA特有的“帽 子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几 个C ,由于有5 帽子结构的 mRNA才能利用这个反应得到能 扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。 3.可以从非常少量的样品中得到大量的高质量的cDNA ,只需要 少至25ng 的mRNA或者50ng的总RNA就可以得到高质量、高产 量的cDNA.产物可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已 知序列扩全长cDNA（RACE)，和用于芯片检测的cDNA探针的扩 增等. 5.环化5RACE法（TaKaRa公司试剂盒） 二.方法 1.RNA的提取 高质量的RNA是实验成功的保证。电泳检测和保存时注意事项。 2.反应体系 反转录、两轮PCR反应体系按试剂盒说明书进行即可。第一轮PCR产物一般经稀释后作为第二轮PCR反应的模板。 3.电泳回收、连接测序 有多条带产生，回收时在合理的范围内尽量全部回收。 第四章 目的基因的分离克隆 第四章 目的基因的分离克隆 第四章 目的基因的分离克隆 2.特异性引物设计：GSP1 、GSP2 2.5-RACE 第四章 目的基因的分离克隆 第四章 目的基因的分离克隆 61 TATCAGCCATGGGAAGCTTGCCATCTCCTCATGATCTGTCCACCACGTTCAACCCTATGG 20 M G S L P S P H D L S T T F N P M 121 ACCTGACTGAGTTATCGACTGAGTCGAGACTCGTCACGGATTTCATAACTCAGTACTACC 40 D L T E L S T E S R L V T D F I T Q Y Y 181 AAACCCTAGAGACCAGACCGGTCCAGCCCCTGGTGAAGCCAGGTTTCTTGACATCTCAGC 60 Q T L E T R P V Q P L V K P G F L T S Q 241 TTCCGGAGGATGCACCATTTTATGGTGAATCCATGGAAGAGATTTTGTCCGATGTGAATG 80 L P E D A P F Y G E S M E E I L S D V N 301 AGAAGATTGTTCCTGGCCTCACCCATTGGCAAAGCCCTAATTTCCATGCTTACTTTCCAG 100 E K I V P G L T H W Q S P N F H A Y F P 361 CAAGTTCCAGCAACGCAGGGCTGATGGGAGAGTTGCTATGCTCCGGACTCAGTGTCATTG 120 A S S S N A G L M G E L L C S G L S V I 421 GGTTTACATGGAGCTCCTCCCCGGCAGCGACCGAGCTTGAGAATGTTGTGGTTGATTGGA 140 G F T W S S S P A A T E L E N V V V D W 481 TGGCCA