半乳糖凝集素-3在人孕早期绒毛和蜕膜中的表达及对胚胎发育的影响-妇产科学专业论文.docxVIP

PBS 缓冲液（0.01M PH7.2-7.4） 上海立瑶生物科技有限公司Trizol（总 RNA 提取试剂）（R0016） 碧云天生物科技有限公司 高效率逆转录试剂盒（Fsk-100） 东洋纺（上海）生物科技有限公司 引物合成 上海生工生物工程技术服务有限公司 SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus（QPK-212） 东洋纺（上海）生物科技 有限公司1.2.2 主要仪器免疫组化防脱玻片 上海仪涛生物仪器有限公司 石蜡切片机（AS325） 英国 SHANDON漂烘片机（YABO） 常州市博雅电子设备有限公司 65℃电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9140A 型） 上海一恒科学仪器有限公司 美的自动电饭煲（MB-YH16） 广东美的电饭煲制造有限公司 封片机 德国 LeicaZEZSS 光学显微镜 蔡司光学仪器（上海）国际贸易有限公司 台式离心机（X-22R） 美国 Beckman Coulter 公司 隔水式恒温培养箱（GHP-90801） 上海一恒科学技术仪器有限公司 PCR 仪（ep gradien） 德国 Eppendorf 公司实时荧光定量 PCR 仪（eprealpex4） 德国 Eppendorf 公司1.3 实验方法1.3.1 标本采集收集手术流产组、药物流产组、稽留流产组，新鲜的绒毛及蜕膜组织，PBS 洗净 血液，将每例标本分成两份，一份即刻于液氮中浸泡后，快速冻存于-80℃冰箱内， 待用以提取 RNA；另一份组织于福尔马林液中固定，行石蜡包埋，待行免疫组织化学检测。1.3.2 免疫组织化学法石蜡块连续切片，厚度为 3um。应用免疫组织化学两步法检测绒毛和蜕膜中的半 乳糖凝集素-3。1.石蜡切片常规脱蜡水化。2.将切片浸于 0.01M 柠檬酸缓冲液（PH=6）中，电饭煲加热修复，煮沸 10min， 保温 10min，自然冷却 30min。3.PBS 洗涤 3 次，各 5min。4.滴加 I 抗（半乳糖凝集素-3 工作浓度 1:500）约 50-100ul，切片置于湿盒内4℃过夜。5.PBS 洗涤 3 次，各 5min。6.滴加 II 抗（SuperPic Ture）50-100ul，室温静置 15min。 7.PBS 洗涤 3 次，各 5min。。8.DAB 显色 5 分钟，放入自来水中终止显色。9.苏木素复染 2 分钟，盐酸酒精分化。10.自来水冲洗。11.脱水、封片、镜检。 以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照。实时荧光相对定量 PCR 法（Real-time RT-PCR）提取细胞总 RNA 分别取黄豆粒大小的绒毛及蜕膜组织于液氮中研磨成粉末→待液氮蒸发后，取2 小勺粉末加入 Trizol 1ml→用力摇晃 15 下左右并打匀→室温下放置 10 分钟→加入 三氯甲烷（按 800Trizol：200 三氯甲烷）→混匀，待静置不分层→分两个离心管（12000 转速，4℃）离心 15 分钟→取上层透明液体加入无水酒精及异丙醇混合液（已放置于-20℃下 10 分钟）达试管平面→离心 20 分钟（12000 转速，4℃），可见白色沉淀→加入无水酒精及 DEPC 混合液（7:3）700ul 冲洗白色沉淀→离心 1 分钟（12000 转 速，4℃）→吸净酒精→离心半分钟（12000 转速，4℃）→吸净酒精，黑色记号笔在 白色沉淀处标记→打开试管盖子，置于 37℃孵化箱 10 分钟→可见白色沉淀基本透明， 加入 20ulDEPC 水→常温下放置 5min。RT-PCR（20ul 体系）5×Buffer4ul10mm dNTP2ul（olg）dT201ulRelor Trace-α1ulRNace Inhititor1ulRNA7ulDepc-H2O4ul荧光定量 PCR（20ul 体系）蒸馏水3.6ulSYBR Green Realtime PCR Master Mix-10ul Plus solution2ul正向引物（10um）1.2ul反向引物（10um）1.2ul模板2ul按文献[18]合成Galectin-3引物序列，上游引物序列为：5-CTT CCA CTT TAA CCC ACG CTT CAA-3，下游引物序列为：5-TGT CTT TCT TCC CTT CCC CAG TTA TT-3，扩增片段长度为93bp。以18s核糖体为内参照，其上游引物序列为：5-CAG CCA CCC GAG ATT GAG CA-3，下游引物序列为：5-TAG TAG CGA CGG GCG GTG TG-3，扩增片段长度为252bp。荧光定量PCR仪为：Eppendorf realplex4。反应条件为：95℃预 变性2min，95℃变性15s，58℃退火30