免疫荧光化学技术g.ppt

　　2. 将上液加入10ml IgG-?巴比妥缓 冲液(0.5mol/L,pH 8.5,内含 50~100mg IgG) 中，室温反应 2h，过 Sephadex G-50 除去游离荧光素， 最大荧光波长 430nm。 AMC 呈黄色结晶固体，最大 吸收波长354nm。 三、荧光抗体的质量控制 　　对制备的荧光抗体必须进行质 量鉴定，主要进行特异性和敏感性 两个方面的鉴定。 ㈠ 染色特异性和敏感性的测定方法 　1. 特异性染色效价测定 　　直接染色效价以倍比稀释荧光抗体溶液如 1:2， 1:4，1:8……，与相应抗原标本作一系列染色，荧 光强度在“+++”的最大稀释度，为其染色滴度(效价) 或单位。实际染色应用时，可取低一个或两个稀释 度(即2~4个单位)，如染色效价为1：64，实际应用 时可取1:32或1:16。间接染色效价可按抗核抗体荧 光染色法步骤，先用不同稀释度的荧光抗体染色， 结果以抗核抗体荧光强度“++”为标准，染色用效价 和直接法相同。 2. 非特异性染色测定 　　根据荧光抗体的用途不同，可用相类似 的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按 常规染色，结果在标本上出现的非特异染色 应显著低于特异染色滴度，否则应采取消除 非特异性染色的方法处理荧光抗体。 3. 吸收试验 　　在荧光抗体中加入过量相应抗原， 于室温中搅拌2h后，移入4℃中过夜， 3000r/min，离心30min，收集上清液， 再用以和相应抗原阳性标本染色，结 果应不出现明显阳性荧光。 ㈡ F/P比值的测定方法 　　F(荧光素)和P (抗体蛋白) 的克分子比 值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般 要求 F/P 的克分子比值为 1~2。过高时， 非特异性染色增强；过低时，荧光很弱， 降低敏感性。 　　1. 蛋白质定量 　　测定荧光抗体的蛋白质mg/ml量。 2. 结合荧光素定量 　　先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取 FITC 1mg，溶于10ml 0.5mol/L pH9.0 碳酸盐缓冲液中， 再用0.01mol/L pH 7.2 PBS稀释到100ml，此时荧光 素含量为10μg/ml，以此为原液，再倍比稀释9个不 同浓度的溶液，用分光光度计在 490nm 波长测定光 密度值 (OD)，以光密度为纵坐标，荧光素含量为横 座标， 作标准函数图。 荧光素与蛋白质结合后，其 吸收光谱峰值向长波方向位移约 5nm，FITC 和蛋白 质结合后由490nm变为 493-495nm，RB200 和蛋白 质结合后变为595nm。 FITC ?g/ml 160000×103 FITC?g/ml 　　　　　　 × 　 = 0.41× 蛋白质 mg/ml 390×106 蛋白质mg/ml 　　式中160000为抗体蛋白质的分子量，390为FITC 的分子量。蛋白质从克换算为毫克需再乘以103，而荧 光素从克换算为微克需要再乘以106。 F/P比值的计算：可按以下公式计算 F/P克分子比值＝ (RB200 ?g/ml×10-3) ÷580 蛋白质mg/ml÷160000(IgG) RB200荧光抗体的克分子比值 ＝ 测定RB200荧光抗体的克分子比值公式如下： A515nmOD 160000 或 ＝ 重量比(g/g) ×　 A280nmOD 580 TMRITC荧光抗体克分子量比值 ＝ 　　按图测定法更为简便，即先用276nm 波长测得蛋白质的OD值，再用493波长测 得FITC的OD值，将这两个OD值连成一直 线，直线与各纵线交叉处， 即可查出标记 抗体的以下数值： FITCμg / ml，F / P 的 g/mg，F/P的克分子比植，蛋白mg/ml等。 ㈢ 荧光抗体的保存 　　以0~4℃或 -20℃低温保存，防止抗体 活性降低和蛋白变性。 最好加入浓度为 1:5000~10000的硫柳汞或者1:1000~5000 的叠氮钠防腐，小量分装如0.1~1ml，真空 干燥后更易长期保存。 FITC 标记物中 球蛋白、荧光色素和 F/P 比值计算图 一、标本制作 　　可制作涂片、印片、细胞单层培养 物或组织切片，经适当固定或不固定， 作免疫荧光染色用。 免疫荧光细胞化学染色方法 二、荧光抗体染色方法 　㈠ 直接方法 　　1. 染色 　　切片经固定后， 滴加经稀释至染色效 价如1:8或1:16的荧光抗体，在室