分子发光荧光磷光和化学发光法.ppt

2.化学发光效率 化学效率： 发光效率： 时刻t 的化学发光强度(单位时间发射的光量子数)： dc/dt 分析物参加反应的速率； 3. 化学发光强度与化学发光分析的依据 在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂少得多，对于一级动力学反应： dc/dt =Kc； K 为反应速率常数。 定性依据： （1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性； （2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性： 4.化学发光反应的类型 （1）气相化学发光反应 a. 一氧化氮与O3的发光反应(可测定空气中NO2的含量） NO + O3 → NO2* NO2* → NO2 + h? 发射的光谱范围：600～875nm，灵敏度1ng/mL； b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应 O3 → O2 + O （1000 ?C石英管中进行） SO2 + O + O → SO2* + O2 SO2 * → SO2* + h? 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/mL； O3 → O2 + O （1000 ?C石英管中进行） NO + O → NO2* NO2 * → NO2 + h? 发射光谱范围：400～1400nm；灵敏度1ng/mL； 氧原子与CO的发光反应： CO + O → CO2* CO2 * → CO2 + h? 发射光谱范围：300～500nm；灵敏度1ng/mL； 氧原子与NO的发光反应： c. 乙烯与O3的发光反应 乙烯与O3反应，生成激发态乙醛： CH2O* → CH2O + h? 最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1 ng/mL ～1?g/mL； （2）液相中的化学发光反应 应用最多的发光试剂：鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）； 鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程： 最大发射波长：425nm 可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2； 鲁米诺- H2O2发光反应速度慢，某些痕量金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等 间接测定某些生物试样 氨基酸 + O2 ????? 酮酸 +NH3 + H2O2 氨基酸氧化酶 葡萄糖 + O2 + H2O ????? 葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。 葡萄糖氧化酶 （3） 生物发光： 生物分子的检测（ATP、NADH） 萤火虫、细菌 ATP的测定 在pH 7～8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺苷(ATP) 反应，生成磷酸腺苷(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)： ATP + LH2 + E + Mg2+ ????AMP· LH2 · E +Mg ppi + 2H+ pH7 - 8 复合物与氧反应，产生化学发光： AMP· LH2 · E + O2 ???[氧化荧光素]* + AMP+CO2 + H2O [氧化荧光素]* ??? 氧化荧光素 + h? 最大发射波长 562nm；可测定10?L试样中10-14g的ATP，线性范围达6个数量级。 5. 装置与技术 装置流程： 发光反应室 光检测器 信号放大器 显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差； 流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大； 6. 特点 灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定2?10-17mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量 仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正； 发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰； 线性范围宽 分析速度快 缺