动物肝脏DNA提取.ppt

生物制药班 小组成员：李新 张妮 台影 杨晨 石维丽 王欣欣 动物肝脏中DNA的提取 1、掌握动物组织总DNA的提取方法及其原理。 2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。 3、学习核酸染色的方法。 一、实验目的： 二、实验原理: 要获得纯的DNA样品，必须考虑以下几点： 如何选材，如何破碎组织细胞？ 如何除去蛋白质？(在真核细胞内，DNA与蛋白质结合成核蛋白的形式存在。因此，分离DNA时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。) 设法除去RNA的污染； 防止DNA酶的降解作用； （一）动物肝脏DNA制备原理 基因组DNA的提取方法 浓盐法：利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度不同将二者分离。 离子去污剂法：利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）等去污剂是蛋白质变性，直接从生物材料中提取DNA。 苯酚抽提法：苯酚既是蛋白变性剂，又能抑制DNase的降解。用苯酚处理匀浆时，由于蛋白与DNA连接键已断，蛋白分子表面又含有很多极性集团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 选 材 要提取动物组织DNA，一般选择细胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。 除去RNA的方法 脱氧核糖核蛋白在浓NaCl（1-2mol／L）溶液中溶解度很大，但在0.14mol／L NaCl溶液中溶解度很低，而核糖核蛋白则溶于0.14mol／L NaCl溶液中，利用这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白分离开来。 除去蛋白质的方法 用氯仿一异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积 95％乙醇溶液可将DNA钠盐沉淀出来。 用十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA。 纯的DNA样品的获得 为了防止DNA酶的降解，提取时可加入适量EDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低DNA酶的活性。 加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。 保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存。 　　（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理： 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。 荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光，并将能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm和360nm的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发出波长为590nm的红橙色荧光。 溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在含EB的溶液中浸泡. 溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的DNA。 (一)材料：动物肝脏 (二)试剂： （1）0.14mol／LNaCl－0.15mol／L EDTA-Na溶液： （2）20％SDS溶液： （3）氯仿一异戊醇(24:1)混合液： （4）95％乙醇溶液。 （5）80％乙醇溶液。 （6） pH8.0TE缓冲液：10 mmol／LTris－HCI，lmmol／L EDTANa，其中含RNA酶20ug／mL。 二、实验材料、试剂和仪器: （7）电泳缓冲液：Tris-硼酸－EDTA（50×TBE）pH8.0。 （8）加样缓冲液：0.25%溴酚蓝（BPB）40%蔗糖。 （9）溴化乙啶（EB）溶液：10μg/ml。 （10）琼脂糖凝胶：浓度为0.7%。 (三)仪器 （1）稳压稳流电泳仪 （2）可调微量移液器 （3）水平电泳槽 （4）暗箱紫外透射仪等。 三、实验步骤： 1．取新鲜动物肝，称取1g，切成小块，加入2ml 0.14mol／L NaCl－0.15mol／L EDTA溶液，于研钵中研磨至匀浆，再加2ml清洗转入离心管中，以4000r／min的转速离心 10min。 2．在上述沉淀物中加入2mL 0.14mol／L NaCl－0.15mol／L EDTA溶液，然后在60℃下，滴加 20％SDS溶液3－5滴，边加边摇动，再摇动 10min，使核酸与蛋白质分离。 3. 加固体氯化钠0.2g混匀，使其最终浓度达到l.4mol／L，水浴30min。 4．加等体积的氯仿一异戊醇，混匀，摇动5