形态学试验常用试剂配置方法 蚌埠医学院科研处.doc

形态学试验常用试剂配置方法 4%多聚甲醛 多聚甲醛4g，加蒸馏水100ml，加热至60℃，搅拌并加入1M NaOH数滴，调pH至7.0，滤纸过滤，现配现用。 0.01MPBS缓冲液 氯化钠 (NaCl) 8.50g 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 3.58g 磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O) 0.39g 加双蒸水至 1000ml 1M NaOH调整pH至7.2-7.4，室温存放。 一袋独立包装的PBS（2000ml）加2000ml蒸馏水溶解。 0.01mol/L枸橼酸缓冲液 柠檬酸 0.2g 柠檬酸三钠 1.5g 加双蒸水至 500ml 1M NaOH调整pH至6.0，现用现配。 铬矾明胶液 铬矾 0.5g 明胶 5g 蒸馏水 1000ml 以500-800ml蒸馏水加温溶解明胶，待其完全溶解后加入铬矾，最后加蒸馏水至1000ml。载玻片事先以酸、碱洗涤剂洗净，蒸馏水洗，烤干，包被时水温不超过70℃。 DAB试剂的配制（以中杉公司的浓缩型DAB试剂盒为例） 在1.5mlEP管内加入1-1.5ml蒸馏水，加入一滴试剂A，混合均匀，然后将试剂B和试剂C各一滴加入其中，再次混匀。 此溶液必须现配现用，配好后避光保存，30分钟内使用，剩余的液体应弃去。 石蜡切片的制备 组织块从固定液中取出，流水冲洗1-2h 脱水：70%酒精→80%酒精→95%酒精Ⅰ→ 95%酒精Ⅱ→无水酒精Ⅰ→无水酒精Ⅱ，各级酒精浸泡30min-1h。 透明：彻底脱水后的组织经苯Ⅰ→苯Ⅱ，各浸泡30mim-1h。 浸蜡：完全透明的组织放入56-58℃石蜡中2-3h。 包埋：被切面向下包埋于石蜡中，冷却后成蜡块。 切片：旋转式切片机将蜡块切成5-10μm薄片，贴在经铬矾明胶处理的载玻片上。 58-60℃烤片2-4小时。 冰冻切片的制备 组织块从固定液中取出或者是刚刚取材的新鲜标本放入20%的蔗糖溶液中直至标本沉底（大约需要12-20小时）； 0.01MPBS缓冲液冲洗，5min； 放入冰冻切片机内进行冰冻固定 待组织快固定好后行连续冰冻切片，片厚5-20μm，放入-20℃冰箱内保存。 免疫组织化学染色步骤 1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 3．3%H2O2溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 4．正常羊血清封闭，37℃，30 min； 5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 6．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 7．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次； 8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间； 9．0.01M PBS终止显色； 10．梯度酒精脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→ 95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min→二甲苯Ⅱ10min； 11．中性树胶封片。 免疫荧光染色步骤 (1)将组织切片脱蜡入水； (2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温； (3)正常羊血清封闭，37℃，60 min； (4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次； (5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次； (6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。 (7)荧光显微镜观察拍照。 细胞免疫组化染色（培养板中染色） 1．培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。