在体RNA干扰技术.ppt

在体RNA干扰技术 内容 一般概念 1 RNAi的研究策略 2 慢病毒体内作用方式 3 慢病毒包装-上海吉凯 3 基因沉默 基因沉默(gene silencing)是指由于各种原因，在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。 基因沉默发生在两种水平上 a. 转录水平的基因沉默(transcriptionalgene silencing，TGS): 由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的 b. 转录后基因沉默(post—transcriptionalgene silencing，PTGS): 即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co—suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。 RNA干扰 RNA 干扰 (RNAi) 是有效抑制基因表达以研究各种细胞类型中蛋白质功能的最佳方法。 在哺乳动物细胞中进行基因抑制的传统 RNAi 方法，是使用由两条合成的、未经修饰的 21mer 寡核苷酸经过退火生成的 RNA 双链来形成短/小干扰 RNA (siRNA)。 siRNA and miRNA ? 相同点/联系点 siRNA miRNA 长度及特征 都约在22nt左右，端是磷酸基，3＇端是羟基 合成的底物 miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的 Dicer酶 依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点 Argonaute家族蛋白 都需要Argonaute家族蛋白参与 RISC组分 二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠；产生了on target和off target的问题 作用方式 都可以阻遏靶标基因的翻译，也可以导致mRNA降解，即在转录水平后和翻译水平起作用 进化关系 可能的两种推论：siRNA是miRNA的补充，miRNA在进化过程中替代了siRNA 不同点/分歧点 siRNA miRNA 机制性质 往往是外源引起的，如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生，属于异常情况 是生物体自身的一套正常的调控机制 直接来源 长链dsRNA 发夹状pre-miRNA 分子结构 siRNA是双链RNA，3‘端有2个非配对碱基，通常为UU miRNA是单链RNA 对靶RNA特异性 较高，一个突变容易引起RNAi沉默效应的改变 相对较低，一个突变不影响miRNA的效应 作用方式 RNAi途径 miRNA途径 生物合成，成熟过程 由dsDNA在Dicer酶切割下产生;发生在细胞质中 pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为60nt的带有茎环结构的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)；这些pre-miRNAs在转运到细胞核外之后再由Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs；发生在细胞核和细胞质中 siRNA and miRNA 不同点/分歧点 siRNA miRNA Argonaute (AGO) 蛋白质 各有不同的AGO蛋白质 各有不同的AGO蛋白质 互补性 一般要求完全互补 不完全互补，存在错配现象 RISCs的分子量不同 siRISCs miRISCs/miRNP 各自的生物学功能不同 ⅰ抵抗病毒的防御机制ⅱ沉默那些过分表达的mRNA；ⅲ保护基因组免受转座子的破坏 对有机体的生长发育有重要作用 重要特性 高度特异性 高度的保守性、时序性和组织特异性 siRNA and miRNA 不同点/分歧点 siRNA miRNA 作用机制 单链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶活性，解开siRNAs，通过反义siRNA链识别目的mRNA片段，通过内切酶活性切割目的片段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的片段。同时，siRNA也可以阻遏3′UTR具有短片断互补的mRNA的翻译（off target）。 成熟的miRNAs则是通过与miRNP核蛋白体复合物结合，识别靶mRNA，并与之发生部分互补，从而阻遏靶mRNA的翻译。在动物中，成熟的单链miRNAs与蛋白质复合物miRNP结合，引导这种复合物通过部分互补结合到mRNA的3′UTR（非编码区域），从而阻遏翻译。除此之外，miRNA也可以切割完全互补的mRNA。 加工过程 siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂 miRNA是不对称加工，miRNA仅是剪切pre-miRNA的一个侧臂，其他部分降解。 对RNA的影响