扫描电镜操作注意事项概要.ppt

扫描电镜样品的制做与观察 解放军总医院骨科研究所 黄靖香 目的 随着组织工程技术的发展兴起，如支架材料 的制作后，需观察样品中的孔径大小 ，与细 胞的相融性，生长形态变化等。用扫描电镜 观察获得清晰图像，是重要的检测手段之一。 电子显微镜分透射和扫描电镜两种，透射电 镜（TEM）是观察样品中的内部结构：如细 胞器等；扫描电镜（SEM）可观察样品中的 表面形态结构。 扫描电镜的优点 景深长，视野广，图像呈三维立体结构，样 品制作较透射电子显微镜简单，功能多，根 据样品性质不同，其处理方法也有所区别， 下面主要介绍组织工程支架、细胞、细胞外 基质等样品的制作技术。 一. 样品制作处理步聚 取样→清洗→第一次固定（戊二醛）→第二 次固定（锇酸）→缓冲液中漂洗→梯度脱水 →醋酸戊酯置换→临界点干燥（改成六甲基 二硅胺烷HMDS代替临界点干燥）→表面喷 镀→扫描电镜中观察。根椐我们的具体情况 加以改进。 1. 材料准备、液体配制： 1）玻璃器皿需泡酸、蒸溜水清冼后灭菌备用。 2）磷酸缓冲液（PBS-0.1M PH-7.4）配制：磷 酸二氢钠2.964g , 磷酸氢二钠29.011g加三蒸水 1000ml，也可用不加酚红无菌Dhankes液代替。 3）固定液的配制：用PBS缓冲液配成2.5%戍 二醛和1%的四氧化锇。 2. 取材准确、固定及时：尽可能保存原貌， 大小适宜（10mm2高5mm左右），对样品表面 用无菌Dhankes液清洗2次，迅速用2.5%戍二 醛4度下前固定4h以上。 3. 观察样品前两天，PBS洗20分钟/次×2次， 以下均在室温下，通风橱中进行。 4．1%四氧化锇酸后固定2h。 缺插图 托上加图片 饿酸固定加图片 单宁酸加图片 5．重复步骤3。 6. 2%单宁酸过滤后洗2次，每次30min。 7．重复步骤3。 8. 梯度乙醇脱水（50 75 90 100）%×2次， 每 次30min，也可在75或90%乙醇中过夜。 9. 醋酸异戊酯置换乙醇40min。 10. 六甲基二硅胺烷原液（HMDS）5-10min替 代临界点干燥，放青霉素瓶中抽真空后密 封。 11. 样品用导电胶贴牢贴平，正面朝上，大小 适宜。置蒸空干燥器内过夜。 12. 第三天早晨，用离子溅射真空镀膜法喷镀 导电金属。 13. 上机观察样品，照相获得二次电子图像。 二. 比较不同干燥方法的优缺点 材料分类 A 单纯支架材料：看孔隙率和孔径大小分布，用普通冷冻 干燥机冷冻干燥法干燥48h的支架→粘贴后→喷金上机观看 干燥喷镀上机观察 B.活细胞不处理环镜扫描直观看细胞 活细胞环镜扫描图 C. 细胞常规梯度脱水：用冷冻干燥机处理 细胞收缩，断裂，立体感差。 冷冻干燥细胞裂缝 冷冻干燥细胞收缩 D. HMDS法替代临界点干燥:处理细胞加支架 HMDS处理后的图像 E. HMDS法替代临界点干燥:处理细胞加支架微细结构的观察：纳米材料(ECM) 猪ECM胶原 犬神经胶原 脐带ECM胶原 背根神经节基质 F. 常规脱水临界点干燥处理后的样品和六甲基=硅胺烷（HMDS）处理的比较 常规处理 HMDS处理 三． 注意事项和要求 1. 取材大小适宜，准确定位，首先洗去赘生物后立即固定，防组织细胞的结构自溶或变形。污染物造成图像表面出现絮状物，轮廓不清。 2. 根据不同样品，采用不同的干燥方法，防止因干燥时间过长，压力过大造成样品过度收缩和断裂。样品厚而贴不牢不平，造成喷镀不均，样品边缘空白，发亮而出现充电现象和边缘效应。图像漂移。为此可降低电压（1-5 KV）减少充电和边缘效应。 3. 用单宁酸的目的为提高二次电子发射率，耐受电子轰击，防止样品断裂。 4. 样品脱水干燥贴牢后，需放置玻璃密封真空（加干燥剂）干燥器皿内。样品喷镀后，最好当天观察，照相,如看不完，还需放干燥器中密封真空保存，防灰尘潮气进入。最好勿超过3个月。 5. 因条件有限，无临界点干燥仪，我们采用六甲基二胺烷（HMDS）代