萱草花粉动力dynamin蛋白生物化学及酶学性质.doc

萱草花粉类动力蛋白（dynamin-like）生物化学及酶学性质 廖俊杰*そ 吴英杰そ 阎隆飞 (中国农业大学生物学院植物生理生化国家开放重点实验室,北京100094) 摘 要 利用FPLC技术从萱草花粉中鉴定并纯化了动力蛋白，研究了它的酶学性质及部分生物化学性质。结果如下: 纯化的动力蛋白分子量为100KD，等电点pI=6.15和6.80。最适pH值为7.0。最适底物依次为GTP＞UTP＞ATP＞ITP＞CTP。GTP酶活性比ATP酶约高3倍，并可被微管激活1.64倍，与牛脑动力蛋白相似。 其米氏常数为8.33×10-4 mol/L，最大反应速度为0.909μmol Pi·min-1·mg-1 Pr.。光谱学研究表明，在激发波280nm下，最大荧光发射波为346nm。圆二色光谱分析表明，其β-折叠占30.78%，α-螺旋为19.73%，其余为无规则卷曲。 药理学性质研究表明，它不同于已鉴定的植物动蛋白，而类似于动物的动力蛋白，推测微管蛋白及其动力蛋白可能在植物细胞运动及信号传递中起重要作用。 关键词：类动力蛋白，分子马达，微管，花粉 中图分类号： 运动是所有细胞的基本功能，是生命活动的基础。细胞生物学家很早就推测细胞内各种各样的运动可能依靠一类机械化学酶(mechanoenzymes)的作用，但一直未能鉴定出相关的分子。 早已知肌球蛋白(myosin)是微丝系统的运动马达，1985年动蛋白(kinesin)及1987年胞质力蛋白(cytoplasmic dynein)发现和鉴定为微管马达蛋白(motor protein) (Vale等1985)，它们作为酶把核苷酸的水解与微管多种形式的运动结合到一起，在真核细胞中起着重要的作用。所以马达蛋白的研究成为现代细胞生物学和生物化学中最热门的领域之一(Skoutias和Scholey1993，Wu和Yan 2002)。Shpetner和Vallee（1989）从牛脑组织中发现一种分子量为100KD的蛋白质， 具有很高的GTP酶活性，但其中ATP酶活性较低。微管能使之激活16倍，他们将此种蛋白质命名为动力蛋白。它是继动蛋白和胞质力蛋白之后在牛脑中发现的第三种微管马达蛋白，在微管滑动和囊泡运输中起着重要作用。 以前有关动力蛋白的研究报道，都来自动物材料。我们以植物萱草花粉为材料，首次在植物细胞内分离了类似神经细胞的动力蛋白( Wu和Yan 2002)，具GTP酶和ATP酶双重酶活性，且GTP酶活性远高于其ATP酶活性，并与牛脑动力蛋白抗体有免疫交叉反应。本文报告萱草花粉类动力蛋白的酶学和生物化学性质。 1 材 料 与 方 法 1.1材 料 萱草(Hemerocallis fulva L.)花粉采自中国医科院药用植物所，收集花药后置于60W灯下 照射，花粉囊开裂后用分样筛收集花粉，干燥后，贮存于-80℃冰箱中备用。 1.2 分离与纯化 取萱草花粉20g用60~100ml提取缓冲液(100 mmol/L PEPES, pH6.9。内含1 mmol/L MgCl2, 1 mmol/L EGTA,1 mmol/L DTT,1 mmol/L PMSF,50μg/ml TAME,50μg/ml TPCK和0.5% PVP)和金钢砂少许，冰浴研碎，得到浅黄色的花粉粗提液。提取液经30%～80%饱和度硫酸铵分段盐析除去杂蛋白和色素，然后采用DEAE-Sephadex A 50柱层析，0.15mol/L KCl 洗脱，收集280nm波长下的洗脱峰液，15,000rpm 4℃离心15min，上清液经过FPLC-Mono Q离子交换柱分离纯化，0~600 mmol/LKCl线性梯度洗脱，最后得电泳纯的类动力蛋白。 1.3 蛋白质分子量测定 参照Lamelli(1970)SDS电泳方法。分离胶浓度10%，浓缩胶浓度4.8%，硝酸银染色（Blum 1987）。利用分子量对数与电泳迁移率关系作图测定蛋白的分子量。 基金项目：国家科学基金资助。 *现在广东轻工职业技术学院工作(E-mail:junjie33@gdqy.edu.cn ;Tel そ前二位作者对本文具有同等贡献。 1.4 GTP酶及ATP酶活性的测定 参考Gonzalex-Romo(1992)等方法。酶活力单位为nmolPi.min-1.mg-1 Pr。 1.5 等电点测定 用Pharmacia全自动phast system等电聚焦仪测定等电点，上样量为4μl，电泳凝胶使用PhastGelTM (5%T,3%C)预制胶,pI为3.0～9.0，硝酸银染色，等电点标准为Pharmacia公司产品。 1.6 园二色谱测定 参照Chen(1974)方法，