miRNA协和课件2002PPT.ppt

可诱导siRNA表达载体 Tet inducible：H1、U6、T7 CRE recombinase－loxP lac repressor：H1 siRNA的设计 有效的比例比较高，平均可达到70-80% 尚无有效的原则可循 一些应考虑的问题： 转录终止序列问题 GC含量 H-ras mRNA nt 1 nt 570 site 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Kazunari Taira et al. Nucleic Acids Research 2003 suppression of endogenous H-ras gene 问 题 siRNA表达载体引起interferon response siRNA序列引起interferon response off-target(脱靶效应) microRNA样作用 非特异性IFN反应 非完全匹配靶基因 * Breakthrough of the Year miRNA----2002 RNAi (siRNA)----2001 小RNA siRNA miRNA 内源性 外源性 广义RNAi：siRNA、miRNA 早期RNAi：siRNA RNAi (RNA interference) RNA干扰 RNAi 现象 sense RNA antisense RNA 1995 Guo dsRNA in vitro transcription sense RNA antisense RNA dsRNA 1998 Fire purify RNAi的发现 RNAi作用机制 Ronald Plasterk. Science 2002 不同的生物中Dicer的种类、数量也不同 至今在哺乳动物中仅发现了一种Dicer 还未找到调节Dicer功能的蛋白质 Dicer RNase III 样酶 Ronald Plasterk. Science 2002 RNAi作用机制 RdRP (RNA-dependent RNA polymerase) 最早是在一些非逆转录RNA病毒中发现 以单链RNA为模板，按碱基配对原则合成其互补链，形成双链RNA 在西红柿、拟南芥、线虫 等均发现其同源物，均参与了RNAi 在真核生物中未发现有特别的功能 在果蝇、人未发现其同源物，但存在有发挥其作用的替代物 具有识别不同RNA的能力，起到“sensor”的作用 Ronald Plasterk. Science 2002 RNAi作用机制 RISC (RNA-induced Silencing Complex) mRNA 解旋酶 核酸内切酶 Argonaute protein siRNA ？？？ 250KD (inactive) 100KD (active) ATP RISC包含siRNA中的一条链 Yang Shi et al. The Lancet 2003 RNAi 作用机制 Brenda Bass. Nature 2001 长dsRNA在哺乳动物细胞会引起非特异性反应 长dsRNA引起非特异性反应的途径 Phillip Sharp et al. Nature Reviews 2002 长dsRNA在一些未分化的哺乳动物细胞中 不会引起非特异性反应，如胚胎畸胎瘤细胞 siRNA(small interfering RNA) P-AGUCCGUAACUGACUACGCUU-OH OH-UUUCAGGCAUUGACUGAUGCG-P 5‘ 5‘ 3‘ 3‘ 21-23 nt siRNA Thomas Tuschl et al，Nature 2001 可以在哺乳动物细胞中直接引发RNAi -----GUGAACAUCACGUACGCGGAAUACUUCGAAAUGUC----- 5’ CGUACGCGGAAUACUUCGAUU UUGCAUGCGCCUUAUGAAGCU 5’ 切割位点 siRNA 双链 靶mRNA Thomas Tuschl etc. Cell 2002 RNAi的特征 是转录后水平的基因沉寂机制 具有很高的特异性 具有很高的抑制效率 在多种生物中都发现有RNAi现象 真菌、植物、线虫、锥虫、果蝇、哺乳动物 影响siRNA抑制效率的因素 靶mRNA的二级结构： 识别序列在靶mRNA的位置，是否可以接近 （contradictory） 与反义核酸的识别序列并不相同 siRNA的修饰 siRNA的GC含量 RNAi与细胞功能 Nucleic