三重实时荧光PCR相对定量法快速诊断21三体及脆性X综合征.DOC

三重实时荧光PCR相对定量法快速诊断21三体及脆性X综合征 刘彦慧1，周万军2，吴亚敏3，黎丽芬3，李超强3 【摘要】 目的 建立三重TaqMan实时荧光PCR技术方法，检测21、X染色体非整倍体。方法 以21号染色体唐氏综合征特异区域（DSCR3）为21号染色体目的基因，选取X染色体1113K一段DNA序列作为X染色的目的基因，同时选择12 号染色体上的磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH) 为参照基因，设计合成三对引物以及分别以不同荧光标记的TaqMan探针，在同一反应管中进行扩增，以相对定量ΔCt值鉴别21号和X染色体非整倍体。并进行PCR反应体系优化以及优化后参数设定和扩增效率等指标的评价，采用建立的技术检测临床标本并进行评价。结果 通过优化，目的基因和参照基因扩增效率基本一致，接近100%，模板量在100 — 600ng g/μL 时三个基因都可以得到有效扩增。采用上述体系检测24例正常标本和20例异常标本(包括血液和羊水标本)，正常标本的21号ΔCt值均为2，而唐氏综合症患者均为3；正常男性的X染色体ΔCt值均为1，而正常女性均为2。其临床标本检测结果的敏感性、特异性、准确率均达百分之百。结论 所建立的三重实时荧光PCR相对定量法快速诊断21三体及脆性X综合征的技术，其稳定性、可靠性和实用性均较好，有望在临床上推广。 【关键词】 三重实时荧光PCR技术；唐氏综合征；非整倍体 染色体异常是导致先天畸形的重要原因，畸形胎儿染色体核型异常的比例位于各类产前诊断指征的第一位[1]。传统的染色体病产前诊断方法是细胞培养,稳定性与可靠性较高，可对染色体数目和结构进行分析，但存在实验过程较长、 操作繁琐、检测通量小，仅能分析中期染色体等缺点。因此，开发新的高特异性和灵敏性,经济省时的检测方法是今后染色体病研究工作中的重点。本文即应用三重TaqMan实时荧光PCR技术，对21、X染色体拷贝数进行相对定量，以期实现其快速诊断，满足大规模临床检测应用。 1 材料和方法 1.1 对象 20例正常人（男10例，女10例）、10例唐氏综合征患者、5例Turner综合征患者、5例克氏综合征患者外周抗凝血标本1.0ml,采自中山大学附属东莞东华医院，均经染色体G 显带分析证实。用酚 基金项目：广东省医学科学技术研究基金项目WSTJJ20071213410781197102150515 作者单位：1、523110广东东莞，中山大学附属东莞东华医院医学遗传学实验室，2、510515广州，南方医科大学基础医学院遗传学教研室 氯仿法抽提基因组DNA，-20℃保存备用，另选择孕中期羊水标本6例，其中4例正常(细胞培养结果为均为46,XY)，2例唐氏综合征患者(47,XY,+21和47,XX,+21各1例)。 1.2 引物及探针设计合成 参照相关文献［2］，于21号染色体的唐氏综合征特异区域选择DSCR3 基因(Down’s syndrome　critical region gene3, DSCR3)为目的基因, 扩增产物长度为132 bp;选取X染色体1113K（ribosomal protein L21 pseudogene 21）一段DNA序列作为X染色的目的基因，扩增长度为147bp;同时选择12 号染色体上的磷酸甘油醛脱氢酶基因glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 为参照基因,扩增产物长度为150 bp（相应引物及TaqMan探针见表1）。以上引物及探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 表1： 目的及参比基因引物、TaqMan探针 Forward Reward Len. Chrom21 CATCCATTAGCAAGTCAGAGGTTTC GAAAACATTGACTGTGGCTCTTG FAM-ctccagcaagctcaaactgctgtcac-TAMRA 132bp ChromX CAATGCGGGAGCGATG CCTTCCTGTGTCTGTCGGTG HEX-cctgatggatttcctcgatgagcc-TAMRA 140bp GAPDH GCCTAGGGCTGCTCACATATTC GGCAACAATATCCACTTTACCAGAG ROX-cctcccctcctcatgccttcttg-TAMRA 135 1.3 三重TaqMan实时荧光定量PCR体系优化 根据2-ΔΔCt法相对定量的方法学要求[3],在验证了各个PCR反应的特异性之后，必须对三重TaqMan实时荧光定量PCR体系进行了优化，以保证三个PCR反应效率基本一致。本研究中，针对PCR反应体系中的Buffer、镁离子、引物、探针、dNTPs等成份的浓度均进行了了一系列优化[4]，以保证