PCR技术在食品微生物中的检测PPT.pptx

PCR技术在食品微生物检测中的应用报告人： 冯 姣PCR技术简介PCR技术的创建史Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR技术简介PCR技术的原理无细胞分子克隆法：在微量离心管中,加入适量的缓冲液, 微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶, 一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 扩增了特异区段的DNA带。PCR技术简介PCR技术分类PCR-DGGE的技术是将PCR和变性梯度凝胶电泳的(DGGE)分析技术结合起来是一种可将长度相同而序列不同的DNA片段混合物分离开的一项技术。DGGE的基本原理是：由于DNA分子中4种碱基的组成和排列存在差异，造成不同序列的DNA分子的解链温度不同，解链时所需的变性剂的浓度也不同。当双链DNA分子在含梯度变性剂（尿素、甲酰胺）的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，会致使序列不同的DNA片段会在各自相应的变性剂浓度下变性，从而使DNA分子的迁移速度不断下降，当产生的迁移阻力与电场力相对平衡时，不同序列的DNA 片段滞留于凝胶的不同位置，形成相互分开的带谱。理论上只要选择的电泳条件足够精细，有一个碱基差异的DNA长段都可以被分开。PCR-DGGE技术具有可检测不可培养类细菌、检测时间短、检测率高、重复性好等优点。免疫磁珠技术（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ　ｂｅａｄｓ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）其原理是磁珠经过一定的处理后，可结合某种微生物特异性抗体，形成免疫磁珠。将这种带有特异性抗体的免疫磁珠加到待测样品中，相应的抗原物质就会和免疫磁珠上的抗体发生特异性结合，形成抗原－抗体－磁珠免疫复合物，此复合物在外加磁场的作用下发生定向移动，使复合物与其他物质分离，从而达到快速分离抗原物质的目的。该技术不仅具备了固相化试剂特有的优点以及免疫学反应的高度特异性，还具有高效、快速、可重复性好、操作简单和不需昂贵的仪器设备等优点。多重PCR(multiplex PCR)的检测原理与传统PCR相同，如果存在与各引物对特异性互补的模板，只不过是在同一反应体系中加入1对以上的特异性引物，那么就可以同时在同一个反应管中扩增出1条以上的目的DNA片段。使用这一方法可以同时检测1个以上目的基因或者借助其交叉限制进行确认。与常规的PCR相比，还具有扩增效率高、产物特异性高和经济简便等特点，特别适合食品中多种致病菌的快速检测.常规PCR检测 在热稳定DNA聚合酶的催化下，常规PCR检测原理是在存在DNA模板、dNTP、引物、适当缓冲液与MgCl溶溶液的反应混合物中，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。实时荧光定量是将荧光能量传递技术应用于传统多聚酶链式反应仪中，通过受体发色团之间偶极–偶极相互作用。检测PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，能量从供体发色团转移到受体发色团，受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比，从而达到定量目的。该技术实现了ＰＣＲ 从定性到定量的飞跃，除了具有常规ＰＣＲ的快速、灵敏、操作方便等特点外，还具有以下优点：全封闭反应，无需凝胶电泳等ＰＣＲ后处理，减小对环境的污染；不使用有毒试剂，操作安全；定量准确；仪器在线实时监测，结果直观多重PCR检测 荧光定量PCR检测 IMS-PCR检测 PCR-DGGE荧光定量PCRPCR技术在食品微生物检测中的应用常规PCR技术的使用 刘胜贵等人利用PCR技术检测猪肉中沙门氏菌，对已知和未知被沙门氏菌污染的猪肉的培养物均能准确检测。对不同稀释度的样品进行PCR扩增，当DNA含量只有0.01pg时，还能扩增出条带，说明该方法检测猪肉中沙门氏菌具有特异性高且灵敏、快速等特点。 巢国祥等人通过PCR法扩增hly基因建立快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌（LM）的方法。并检测模拟污染生猪肉、水和牛奶，检测限达10cfu/25g（ml）。PCR技术在食品微生物检测中的应用COCOLIN等建立一种直接检测食品中李斯特菌属的分子生物学方法。通过PCR扩增李斯特菌和标准菌株的特异iap基因，扩增产物再用DGGE进行分离，鉴定出五种李斯特菌。李苗云等研究冷却猪肉贮藏过程中的微生物变化，直接提取不同冷藏天数肉样DNA，对细菌16SrDAN的v6-v8区段进行PCR扩增，通过DGGE