PCR原理及引物设计PPT.ppt

藏珠馆 LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO PCR引物设计 引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。 具体因素 如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用?G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。 一般原则 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不应大于38。 引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。 例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个. 较长的引物（28-35bp) 一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点 一般原则 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。  一般原则 4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 一般原则 5. ?G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?G 值较低，而5’端和中间?G 值相对较高的引物。引物的3’端的?G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合） 一般原则 6. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 7. 引物二级结构对PCR反应的影响。 尽可能少的引物二聚体。  Primer Premier 5.0 的使用技巧简介 主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 Primer Premier 5.0使用介绍(1) Preimer Premier 启动界面 Load sequence 基本信息 Sequence name Original sequence Choose a function 引物设计界面 First you can design the primer manually Sense strand or anti-sense strand Useful information of the primer 引物有哪些信誉好的足球投注网站选项设定 引物类型 有哪些信誉好的足球投注网站模式 5’引物位置范围 3’引物位置范围 产物大小范围 引物长度 有哪些信誉好的足球投注网站结果 28对引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信息 双击选中一对引物 引物信息 回到主窗口 引物及产物信息 是否出现hairpin,dimer,false priming and cross dimer 藏珠馆 LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO LOGO